1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA O papel dos polissacarídeos algais extracelulares na dinâmica de metais no reservatório de Barra Bonita SANDRA PROTTER GOUVÊA Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências (Campo de Pesquisa: Fisiologia e Bioquímica dos Microrganismos). SÃO CARLOS – SP 2004 2 Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária/UFSCar G719pp Gouvêa, Sandra Protter. O papel dos polissacarídeos algais extracelulares na dinâmica de metais no reservatório de Barra Bonita / Sandra Protter Gouvêa. -- São Carlos : UFSCar, 2004. 97 p. Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2004. 1. Bioquímica. 2. Cádmio. 3. Cobre. 4. Complexação. 5. Anabaena spiroides. 6. Aulacoseira granulata. 7. Microcystis aeruginosa. I. Título. CDD: 574.192 (20a) 3 ____________________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Armando Augusto Henriques Vieira 4 Agradecimentos Ao orientador Prof. Dr. Armando A. H. Vieira, obrigada pela orientação científica na área de fisiologia e cultivo de microalgas, pelos ensinamentos imprescindíveis ao ambiente acadêmico, e sobretudo pela amizade e paciência. À co-orientadora Profa. Dra. Ana T. Lombardi, obrigada pela orientação na área de coleta e análise de metais-traço, pela ajuda com os artigos, sugestões ao projeto e a oportunidades de estágio, e também pela amizade e paciência, que foram as mais prezadas qualidades de meus orientadores. Ao técnico Luis Sartori, por ter soluções a todos os problemas de laboratório e experimentos, e pelo apoio inestimável em todos estes anos de convivência. Aos companheiros do laboratório de Ficologia, Danilo, Cristina, Vanessa, Zezé, Pedro, Thaís, Mic, Sebastião, Maria, Mariana, Roseli, por compartilhar o ambiente de trabalho que tenho certeza ser muito especial a todos. Ao pessoal do Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos Naturais, Prof. Dr. José Eduardo, Renata, João, Roseli, Eduardo, pelo apoio às atividades acadêmicas, principalmente na representação do programa da pós e com o preparo das defesas. À Universidade Federal de São Carlos, pela infraestrutura. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo contrato 00/03122-0, que amparou o projeto de doutoramento e o estágio no exterior. À Banca Examinadora da defesa de qualificação, Prof. Dr. Irineu Bianchini Jr., Profa. Dra. Odete Rocha e Profa. Dra. Mirna J. L. Godinho, pelas críticas e correções ao artigo. À Banca Examinadora da defesa de doutorado, Prof. Dra. Ana Teresa Lombardi, Prof. Dra. Odete Rocha, Prof. Dr. Otaciro R. do Nascimento, Prof. Dr. Antônio A. Mozeto e Prof. Dr. Armando A. H. Vieira, pelo aceite do convite da participação e pelas opiniões. 5 Aos técnicos de campo Luiz A. Joaquim e Airton S. Soares, pelo apoio incondicional nas coletas de campo. Ao Prof. Dr. Pedro Senna (in memorian) e Maria da Graça M. Souza (UnB) pela ajuda na identificação das espécies À Zezé (Maria José Dellamano de Oliveira), pelas dicas de contagem de células e preservação de amostras de fitoplâncton. À Vanessa Colombo, pelo apoio nas análises fluorométricas. Ao Prof. Dr. Irineu Bianchini Jr. e Marcela B. C. Santino, pelo uso do TOC. À Telma Blanco, do CCDM – UFSCar, pela análise de metais por espectrometria de absorção atômica. Ao Prof. Dr. Orlando Fatibello, pelas dicas, empréstimo de eletrodos e de mercúrio. Ao Prof. Dr. Marco Grassi e Fernando Sodré, do laboratório de química ambiental da UFPR, pela complementação de análises por DPASV, e pela hospitalidade. Ao Prof. Dr. Michael Twiss, pelo estágio e projeto de trabalho na Clarkson University (Potsdam, NY, USA), pelos ensinamentos em limnologia e coleta nos Grandes Lagos. Ao pessoal da Clarkson University e de Potsdam: Ângela e Andrew + Lucie, Ming the Mercyless, Mousie e Max (in memorian), Alan e John Paul + Baby, Lucky e Socks, Carrol e Jim + Jedi, Penny, Wizard e Angel, Siew Hee + Billy, Diane, Monaj, Dr. Twiss e sua família Tammy, Madeleine, Mary, Avery + Tippy e o gato, pela hospitalidade. Em especial aos meus pais Bonina e Firmino, e à minha avó Carmela, que sempre me apoiaram, e tiveram muita paciência e amor. Ao José Ricardo, que, segundo a filosofia da existência como uma ilha, tem sido a ilha mais próxima. 6 SUMÁRIO A) ABREVIAÇÕES 8 B) LISTA DE FIGURAS 9 C) LISTA DE TABELAS 11 D) RESUMO 14 E) ABSTRACT 15 1) INTRODUÇÃO 16 2) HIPÓTESES E OBJETIVOS 24 3) METODOLOGIA 26 3.1) Área de estudo 26 3.2) Espécies fitoplanctônicas. Isolamento e manutenção em laboratório 28 3.3) Seleção dos metais estudados 30 3.4) Estudo de campo 31 3.4.1) Coleta das amostras 31 3.4.2) Variáveis físico-químicas 32 3.4.3) Análise dos monossacarídeos de amostras da água do reservatório 33 3.4.4) Análises dos metais 33 3.4.4.1) Especiação de Cu e Cd na água do reservatório 34 3.4.4.2) Capacidade de complexação da água do reservatório com Cu e Cd 39 3.4.4.3) Modelagem dos dados de especiação 40 3.5) Estudo de laboratório 41 3.5.1) Curvas de crescimento das microalgas 41 3.5.2) Obtenção dos materiais de alta massa molecular das culturas e da água do reservatório 42 3.5.3) Análises dos materiais de alta massa molecular das culturas e da água do reservatório 42 3.5.3.1) Capacidade de complexação com Cu e Cd 43 3.5.3.2) Composição monossacarídica 43 3.5.3.3) Proporção dos elementos C, H, N e S 44 3.5.3.4) Análise de fluorescência do material de alta massa molecular da água do reservatório 44 7 4) RESULTADOS 45 4.1) Estudo de campo 45 4.1.1) Parâmetros físico-químicos 45 4.1.2) Composição monossacarídica de amostras da água do reservatório 52 4.1.3) Metais na água do reservatório: especiação e complexação de Cu e Cd 54 4.2) Estudo de laboratório 64 4.2.1) Cultivo das microalgas e rendimento dos materiais de alta massa molecular 64 4.2.2) Complexação de Cu e Cd pelos materiais de alta massa molecular 66 4.2.3) Composição monossacarídica e elementar 71 4.2.4) Fluorescência do material de alta massa molecular da água do reservatório 74 5) DISCUSSÃO 76 6) CONCLUSÕES 85 7) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 86 8 A) ABREVIAÇÕES ANOVA: análise de variância ccap: capacidade de complexação aparente CL: concentração de ligantes COD: carbono orgânico dissolvido COT: carbono orgânico total Da: dáltons DPASV: voltametria de redissolução anódica por pulso diferencial E: irradiância HPLC: cromatografia líquida de alta resolução I: força iônica ISE: eletrodos íon-seletivos K’: constante de estabilidade condicional kd: coeficiente de extinção vertical MAMM: materiais de alta massa molecular ML: metal ligado Mláb: metal lábil MMO: metal associado à matéria orgânica MOD: matéria orgânica dissolvida Mtot: metal total M+: metal iônico NTA: ácido nitrilo-triacético PC: policarbonato PIPES: Piperazina – N, N’ – bis [2 – ácido etanosulfônico] PSF: polisulfona r: índice de correlação de Pearson TDS: total de sólidos dissolvidos TEP: transparent exopolimer particles UV: Ultra-violeta ZDS: profundidade do Disco de Secchi ou transparência da água Zeu: zona eufótica Zmax: zona máxima µ: taxa específica de crescimento 9 B) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação esquemática da ciclagem de metais-traço em um lago. Adaptado de Sigg (1993). ML = metal associado a ligante. 19 Figura 2. Reservatório de Barra Bonita, com o ponto de coleta das microalgas e de amostras de campo. Adaptado de Calijuri (1999). 27 Figura 3. Esquema de especiação dos metais Cu e Cd para a água filtrada (0,45 µm) do reservatório. ISE = eletrodos íon-seletivos. DPASV = voltametria de redissolução anódica. 35 Figura 4. Curva de calibração para o eletrodo íon seletivo de Cd. Eletrodo de referência: Ag/AgCl. 36 Figura 5. Curva de calibração para o eletrodo íon-seletivo de Cu. Eletrodo de referência: Ag/AgCl. 36 Figura 6. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas realizadas em 20/03/2001 – outono (A) e 09/07/2001 –inverno (B). 46 Figura 7. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas realizadas em 17/10/2001 – primavera (A) e 21/01/2002 – verão (B). 47 Figura 8. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas de 25/06/2002 – inverno (A) e 14/10/2002 – primavera (B). 48 Figura 9. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas de 13/01/2003 – verão (A) e 28/04/2003 – outono (B). 49 Figura 10. Exemplo de perfil da irradiação solar. Porcentagens de incidência em relação à superfície são indicadas abaixo dos pontos de leitura. E = irradiância. 50 10 Figura 11. Exemplos de polarogramas obtidos nas determinações de Cu (A) e Cd (B), através de DPASV. 56 Figura 12. Exemplos de curvas de titulação da água do reservatório com Cu ( ) e Cd ( ). Não complexação (---) : [metal total] = [M 2+]. Barras: erro da média (n = 3). 58 Figura 13. Exemplo de análise gráfica pelo método de Scatchard para titulação da água do reservatório com Cu. ( --- ) Regressão linear para cálculo dos parâmetros de complexação das classes (1) e (2) de ligantes. 59 Figura 14. Exemplos de adição de padrão interno e regressão linear das leituras em DPASV para obtenção das inclinações de reta de brancos e da água do reservatório, em análises da capacidade de complexação aparente de Cu e Cd. 61 Figura 15. Concentrações de Cu2+ obtidas por ISE e pela modelagem dos dados, em função das concentrações totais obtidas em cada coleta sazonal. Barras: erro da média (n = 3). 63 Figura 16. Curvas de crescimento de Aulacoseira granulata, Microcystis aeruginosa e Anabaena spiroides por número de células por ml e concentração de clorofila-a por mL. 65 Figura 17. Curvas de titulação dos materiais de alta massa molecular (MAMM) com Cu (•) e Cd ( ). (A) Barra Bonita, (B) mistura dos MAMM das três microalgas, (C) A. granulata, (D) A. spiroides, (E) M. aeruginosa. I = 1,0 x 10-1 M (NaNO3), pH = 6,8 – 7,0 (PIPES 7,5 x 10-3 M). Valores em log da concentração de metal livre em função do log de metal total. (---):Não complexação (---) : [metal total] = [M 2+]. Barras: erro da média (n = 3). 67 Figura 18. Exemplos de análises gráficas pelo método de Scatchard das titulações dos materiais de alta massa molecular de A. spiroides com Cu e Cd. Metal associado aos ligantes por metal livre (ML/M2+) versus metal associado aos ligantes (ML). (---) Regressões lineares para cálculo dos parâmetros das classes de ligantes 1 e 2. 69 11 Figura 19. Constantes de estabilidade condicional da classe 1 de ligantes (K’1) em função das respectivas concentrações de ligantes (CL1) divididas pelo conteúdo de carbono orgânico total (COT). (---): Regressão linear. 72 Figura 20. Gráficos das concentrações de soluções do MAMM de Barra Bonita versus intensidade (pico de fluorimetria), soluções versus carbono orgânico total (COT) e COT x intensidade. 75 C) LISTA DE TABELAS Tabela 1. Exemplos de formas metálicas de importância toxicológica e ambiental. Fonte: Twiss et al. (2001). 18 Tabela 2. Características principais do reservatório de Barra Bonita. 28 Tabela 3. Condições de cultivo das microalgas. 29 Tabela 4. Concentrações totais de dez metais presentes no reservatório, analisadas no Centro de Caracterização de Materiais – UFSCar, por espectrometria de absorção atômica. 31 Tabela 5. Parâmetros para a determinação dos metais cobre e cádmio por DPASV. 37 Tabela 6. Teste de destruição da matéria orgânica presente na amostra filtrada do reservatório usando-se o reator de fotodegradação. Temperatura interna do reator ≅ 50 ºC. 38 Tabela 7. Teste de fotodegradação da matéria orgânica em 8 h de exposição ao reator de fotodegradação. Leituras de fluorescência em λ excitação = 313 nm e λ emissão = 330-600 nm. 38 Tabela 8. Dados de transparência da água pelo disco de Secchi (ZDS), coeficiente de extinção vertical da luz (kd), zona eufótica (Zeu), profundidade máxima (Zmax), 12 concentrações de clorofila-a e carbono orgânico dissolvido (COD) das coletas sazonais. Média ± erro da média. 50 Tabela 9. Composição e quantificação dos monossacarídeos totais dissolvidos da água do reservatório, nas coletas sazonais. Concentração em mg L-1 e porcentagem em relação à concentração total quantificada. 53 Tabela 10. Concentrações totais de Cu e Cd e das espécies iônicas e associadas à matéria orgânica. Média e ± erro da média (n = 3). 55 Tabela 11. Concentrações de cobre lábil, total dissolvido, total recuperável, da fração do total recuperável proveniente da fase particulada, e a concentração recuperável por g de total de sólidos dissolvidos. 58 Tabela 12. Complexação de Cu pela água filtrada de Barra Bonita. Parâmetros constante de estabilidade condicional (K’) e concentração de ligantes (CL), obtidos por ISE e capacidade de complexação aparente (ccap), obtida por DPASV. Média e ± erro da média (n = 3). 59 Tabela 13. Valores médios das coletas sazonais dos parâmetros de complexação K’ e CL, metal total e metal iônico medidos nas coletas, e metal iônico estimado pelo modelo de especiação. 62 Tabela 14. Espécies de Cu e Cd, concentrações e constantes de estabilidade condicional para a modelagem da fração dissolvida da água do reservatório. CuBB: Cu associado à classe 1 de ligantes de alta massa molecular da água do reservatório. 62 Tabela 15. Dados dos cultivos das microalgas e da coleta de água do reservatório para obtenção dos materiais de alta massa molecular (MAMM). Dia de isolamento do MAMM nos cultivos e de coleta de campo, concentrações de clorofila-a, taxas de crescimento específicas (µ), rendimento do MAMM e concentrações de carbono orgânico total (COT) das soluções de 50 µg mL-1 de MAMM. Média ± erro da média, n=3. 66 13 Tabela 16. Parâmetros de complexação de Cu e Cd obtidos pelo método de Scatchard e os dados de titulações com os materiais de alta massa molecular excretados pelas 3 microalgas estudadas, da mistura destes, e da água do reservatório, e total de metal complexado por mg dos materiais. Constante de estabilidade condicional (K’) reportada em log e concentração de ligantes (CL) reportada em M. Erros-padrão de tréplicas das titulações: log K’1 até ± 0,1, CL1 até ± 0,5, log K’2 e CL2 até ± 0,3. 68 Tabela 17. Teste ANOVA paramétrico das comparações entre as constantes de estabilidade condicional (log K’) e concentração de ligantes correspondentes entre os MAMM. ns = diferenças não significativas. * = diferenças significativas. 70 Tabela 18. Capacidade de complexação aparente (ccap) de soluções dos materiais de alta massa molecular (MAMM) com Cu e Cd por DPASV e as concentrações de carbono orgânico total (COT) das soluções tituladas. Média ± erro da média (n = 3). 72 Tabela 19. Composição dos monossacarídeos e análise elementar dos materiais de alta massa molecular (MAMM). Monossacarídeos reportados em porcentagens referentes ao material total. C, H, N e S reportados em proporções e sem correção da massa atômica. Média ± erro da média (n=3). 73 14 D) RESUMO A influência do fitoplâncton e de seus produtos excretados resultantes da fotossíntese em corpos d'água têm sido o enfoque de vários trabalhos que investigam a especiação e o destino de metais. Este estudo teve como hipótese a potencial influência dos materiais de alta massa molecular excretados por três espécies fitoplanctônicas (Anabaena spiroides, Microcystis aeruginosa e Aulacoseira granulata), dominantes no reservatório de Barra Bonita, em relação à especiação e complexação dos metais Cu e Cd na água do reservatório. Para tanto o estudo foi dividido em investigações de campo e experimentos de laboratório. Coletas sazonais por um período de dois anos no reservatório foram avaliadas quanto às espécies dissolvidas totais, orgânicas e iônicas de Cu e Cd, a determinação dos parâmetros de complexação destes metais com ligantes presentes na água, assim como o conteúdo de carbono orgânico dissolvido e os parâmetros físico-químicos da coluna d’água. Uma modelagem da especiação química dos metais estudados foi feita com o uso das concentrações totais e os parâmetros de complexação adquiridos nas coletas sazonais. No laboratório foram obtidos os materiais de alta massa molecular excretados em cultivos das microalgas selecionadas, e o material de alta massa molecular dissolvido na água do reservatório, isolado seguindo- se o mesmo procedimento usado para os excretados algais. Estes materiais foram analisados quanto aos parâmetros de complexação com Cu e Cd, e composição monossacarídica e elementar (C, H, N e S). A especiação do Cd na água do reservatório foi dominada por formas iônicas, enquanto o Cu estava em grande maioria associado à matéria orgânica dissolvida. A água do reservatório apresentou, nas coletas sazonais, ligantes para Cu com parâmetros de complexação semelhantes em todo o período estudado. Nas condições experimentais empregadas, não foi detectada a complexação de Cd com ligantes oriundos da água do reservatório. A modelagem da especiação de Cu resultou em uma concentração semelhante de Cu2+ àquela medida em amostras de campo, e maior associação do Cu aos ligantes caracterizados neste estudo. O Cu foi complexado tanto pelos materiais de alta massa molecular das microalgas como também pela água do reservatório, enquanto o Cd foi complexado somente pelo material excretado pelas cianofíceas. Maiores proporções de monossacarídeos ácidos nos materiais corresponderam a parâmetros de complexação de Cu e Cd com valores mais elevados. No entanto, não foi observada uma relação entre as proporções de C, H, N e S e a complexação dos metais. Os excretados das microalgas dominantes no reservatório apresentaram ligantes para Cu com força de associação de intermediária a fraca, assim como os ligantes presentes no reservatório. Estes resultados confirmam o potencial de influência dos excretados na especiação, mobilidade e destino de metais com comportamento semelhante ao Cu, no reservatório de Barra Bonita. Palavras-chave: Cádmio, cobre, complexação, materiais de alta massa molecular, microalgas de água doce, reservatório de Barra Bonita, Aulacoseira granulata, Anabaena spiroides, Microcystis aeruginosa 15 E) ABSTRACT The influence of phytoplankton and their excreted materials in natural waters have been considered important issues among metal speciation studies. This work focused on the potential influence of the high molecular weight materials excreted by dominant phytoplankton species of Barra Bonita reservoir (Anabaena spiroides, Microcystis aeruginosa and Aulacoseira granulata) in the speciation and complexation of Cu and Cd. Therefore, this study comprised field and laboratory studies. Seasonal samplings were made during a period of two years in the reservoir. The total, ionic and organic concentrations of Cu and Cd were determined, as well as the complexation parameters with ligands present in the reservoir water. Also, the dissolved organic carbon and physico-chemical parameters of the water column were obtained. A speciation model was applied to metal complexation parameters and total metal concentrations obtained in field investigations. Laboratory cultures of the selected microalgae were made to obtain high molecular weight excreted materials. In a similar manner, the high molecular weight materials were isolated from the reservoir water. These materials were analysed for metal complexation with Cu and Cd, monosaccharide composition and elemental analysis (C, H, N and S). In the reservoir water, Cd speciation was dominated by ionic species, while Cu was mostly associated to the dissolved organic matter. Seasonal samplings presented Cu ligands with similar complexation parameters for the entire period studied. Cd complexation was not detected in the reservoir water. The speciation model resulted in similar Cu2+ concentration to the mean value obtained in field analyses, and indicated higher Cu association to the ligands of the reservoir water. Cu was complexed by all high molecular weight materials studied, while Cd was complexed solely by the cyanophyte materials. Higher proportions of acid monosaccharides in the high molecular weight materials corresponded to higher Cu and Cd complexation parameters, whereas no relation between C, H, N and S proportions and metal complexation properties of the high molecular weight materials was observed. The excreted materials of dominant microalgae from Barra Bonita reservoir had Cu ligands with intermediate to weak binding strength, as those present in the reservoir water. These results indicate the potential influence of such organic materials in metal speciation, bioavailability and mobility of metals with similar behaviour to that of Cu in the reservoir water. Keywords: Cadmium, copper, complexation, high molecular weight materials, freshwater microalgae, reservoir water, Aulacoseira granulata, Anabaena spiroides, Microcystis aeruginosa 16 1) INTRODUÇÃO Os processos químicos e biológicos são complementares e intimamente ligados na regulação dos ecossistemas aquáticos (Buffle & DeVitre, 1993). Como exemplo, nutrientes essenciais ao crescimento e sobrevivência do fitoplâncton são transformados, através da fotossíntese, em componentes celulares. Estes compreendem as células vivas e debris após senescência e morte, como também substâncias orgânicas dissolvidas, liberadas por excreção ativa ou após a autólise. Esse conjunto de materiais fica sujeito ao consumo por heterótrofos, formação de agregados, decomposição até a remineralização e reutilização, como também são envolvidos em processos biogeoquímicos ligados à sedimentação e resuspensão de compostos na coluna d’água. Portanto, os microrganismos aquáticos podem, em muitos aspectos, afetar e modificar o ambiente abiótico aos quais estão expostos (Brönmark & Hansson, 1998). A topografia local, hidrologia, biologia, geologia, condições climáticas e precipitação determinam a entrada e balanço de metais em corpos d’água como lagos, reservatórios e rios. No entanto, a atividade humana tem aumentado a concentração de metais em muitos dos sistemas aquáticos naturais, através de drenagem de mineração, efluentes domésticos, industriais e de agricultura. Isto tem aumentado o interesse em estudos relacionados às concentrações e transporte de metais em corpos d’água (Neubecker & Allen, 1983; Gundersen & Steinnes, 2003). Os compostos aquáticos são constituídos de alguns poucos elementos principais, presentes em altas concentrações, e.g. C, H, O, N, S, Mg, Ca, Cl, K, Na, Si. Elementos- traço, assim chamados por normalmente estarem presentes em baixas concentrações, incluem metais essenciais à nutrição da biota, assim como metais e metalóides tóxicos. Entre os metais micronutrientes essenciais à fisiologia celular destacam-se o ferro (Fe) e cobre (Cu), presentes na composição e funcionamento de várias enzimas, como as catalases, superóxido-dismutases, citocromo oxidases, cupreínas entre outras. Outros metais como o cádmio (Cd) e mercúrio (Hg) não têm função biológica conhecida e são tóxicos. Alguns metais-traço, como o Cu, podem tornar-se tóxicos quando presentes em concentrações pouco mais elevadas que aquela requerida para o crescimento do plâncton (Simkiss, 1979; Stokes, 1983; Buffle & DeVitre, 1993). A exposição dos organismos aquáticos aos metais-traço pode dar-se em três níveis: metais no ambiente externo, circundando a célula; interações dos metais com a membrana biológica que separa a célula do ambiente exterior; partição de metais dentro 17 do organismo e os efeitos biológicos inerentes da presença intracelular (Twiss et. al. 2001). Os efeitos tóxicos do excesso dos metais aos organismos podem ser intensificados ou amenizados dependendo das características fisiológicas e genéticas dos organismos, da presença de um mecanismo intracelular de desintoxicação, e da mitigação da toxicidade no ambiente aquático antes que os metais interajam diretamente com o organismo (Jardim, 1983). Tanto a limitação quanto a toxicidade de metais para organismos aquáticos são função da biodisponibilidade destes elementos, que por sua vez é dependente das formas químicas e físicas do metal, ou seja, da especiação. A especiação física dos metais compreende as formas dissolvidas, coloidais e particuladas, enquanto a especiação química inclui formas não complexadas e complexadas a compostos inorgânicos, como OH-, HCO3 -, NH3, PO4 3- Cl-, e orgânicos, como exemplo aminoácidos, proteínas, ácidos húmicos e polissacarídeos (Neubecker & Allen, 1983; Allen & Hansen, 1996; Twiss et al. 2001). Espécies metálicas são exemplificadas na Tabela 1 (Twiss et al. 2001). O estudo da especiação em águas naturais é imprescindível ao entendimento dos ciclos biogeoquímicos dos elementos nestes ambientes. A ciclagem biológica inclui a bioacumulação, a bioconcentração, a biodisponibilidade e a toxicidade, e a ciclagem geoquímica envolve o transporte, adsorção e precipitação dos elementos nos sistemas aquáticos (Florence, 1986). Além da atividade biológica e biodisponibilidade, o destino de metais nos ambientes aquáticos também é dependente da especiação metálica (McCrady & Chapman, 1979). Elementos-traço, introduzidos em lagos e reservatórios através de rios, escoamento de água dos solos ou deposição atmosférica, são envolvidos em vários processos químicos, biológicos e físicos que determinarão as concentrações presentes na coluna d’água, em sólidos suspensos e nos sedimentos (Figura 1). Enquanto os metais nas formas livre e em solução são determinantes nas interações com a biota, a associação e deposição com materiais particulados são considerados os processos mais importantes de remoção de íons metálicos da coluna d’água. A distribuição dos metais entre compostos dissolvidos e particulados depende da composição do material particulado e dos processos de associação (adsorção a superfícies, assimilação pela biota, precipitação de fases sólidas), assim como da especiação dos íons metálicos em solução (complexação a compostos dissolvidos inorgânicos ou orgânicos). Nestes processos, tanto materiais orgânicos biogênicos (e.g. algas, debris, agregados, 18 excretados) quanto materiais inorgânicos (e.g. óxidos de ferro e manganês, carbonato de cálcio) contribuem para a associação e transporte dos metais. Em lagos e reservatórios, a produção fotossintética e a excreção das algas, assim como a sedimentação destes produtos são considerados processos dominantes e essenciais na remoção de íons metálicos para o sedimento (Sigg et al. 1987; Sigg, 1993). Tabela 1. Exemplos de espécies metálicas de importância toxicológica e ambiental. Adaptada de Twiss et al. (2001). Forma do metal Exemplos A. Íons livres Al3+(H2O)6 Cu2+(H2O)6 B. Complexos hidroxi-metálicos AlOH2+, Al(OH)2 +, Al(OH)4 - FeOH2+, Fe(OH)2 +, Fe(OH)4 - Cu(OH)2 0 C. Complexos inorgânicos simples AlF2+, AlF2 + CdCl+, CdCl2 0, CdCl3 - HgCl2 0, HgOHCl0 CuCO30 CdSO40 D. Complexos orgânicos simples: i) sintéticos Cu-EDTA2- Cd-NTA- ii) naturais Cd-alanina Cd-citrato Fe-sideróforo E. Complexos orgânicos poliméricos Al, Fe, Cu, Pb ou Hg – ácidos fulvicos ou húmicos F. Compostos mistos orgânicos e inorgânicos (Bevilacqua, 1992) Al, Fe, Cu, Pb, Hg - ácidos fúlvicos – sílica ou alumina 19 Figura 1. Representação esquemática da ciclagem de metais-traço em um lago. Adaptado de Sigg (1993). ML = metal associado a ligante. 20 A toxicidade de metais ao fitoplâncton tem sido relacionada diretamente às concentrações de íons livres ao invés da concentração total (Anderson & Morel, 1978; Sunda & Lewis, 1978). A complexação geralmente diminui a biodisponibilidade e toxicidade dos metais (McKnight & Morel, 1979; Bruland et al. 1991, Sunda & Huntsman, 1998) embora exceções ao modelo do íon livre para explicar a toxicidade tenham sido reportados. Como exemplo deste fenômeno podem ser citados os complexos com carbonatos, lipídios e citrato, que facilitam a entrada de metais nas células (Phinney & Bruland, 1994; Allen & Hansen, 1996; Errecalde et al. 1998, Errecalde & Campbell, 2000). Deste modo, estudos da especiação de metais em sistemas aquáticos têm aumentado em número e importância pois são obtidas informações imprescindíveis para a predição e interpretação da toxicidade dos metais aos organismos aquáticos (Twiss, 1996; Sunda & Huntsman, 1998). Várias são as metodologias e equipamentos usados no estudo da especiação e complexação de metais em meio aquoso. Alguns deles são citados abaixo, com exemplos de trabalhos que os empregaram: a) Voltametria de redissolução catódica com troca de ligantes competitivos, LE- CSV (Xue & Sigg, 1993; Moffett, 1995; Achterberg et al. 2002; Twiss & Moffett, 2002); voltametria de redissolução anódica com pulso diferencial, DPASV (Chau et al. 1974; Kozarac et al. 1989; Mylon et al. 2003). b) Gradiente de difusão em filmes finos, DGT (Zhang & Davidson, 2001; Twiss & Moffett, 2002) c) Eletrodos íon seletivos, ISE (Fish & Morel, 1983; Lombardi & Vieira, 1998) d) Bioensaios (Morrison & Florence, 1989) e) Espectrometria de absorção atômica, AAS (Mylon et al. 2003) f) Resinas de troca iônica (Morrison & Florence, 1989) g) Traçadores radioativos (Achterberg et al. 2002; Garnier & Guieu, 2003) h) Extinção de fluorescência (Saar & Weber, 1982; Lombardi & Jardim, 1997) A especiação dos metais é muitas vezes determinada através da combinação entre várias técnicas (e.g. Morrison & Florence, 1989; Achterberg et al. 2002; Twiss & Moffett, 2002; Mylon et al. 2003). Também são muito utilizadas modelagens da especiação de metais, feitas com auxílio de programas de computador, desde que haja informação detalhada das reações de complexação, como concentrações e constantes de estabilidade condicional dos ligantes e estequiometria dos compostos. Estes modelos são usados para cálculo indireto da concentração dos íons livres em ambientes naturais 21 (e.g. Mylon et al. 2003), como também em estudos do efeito dos íons no crescimento e toxicidade para células algais (e.g. Macfie et al. 1994; Ahner & Morel, 1995; Lombardi et al. 2002). Vários estudos de especiação em meio aquoso consideram a importância da matéria orgânica dissolvida (MOD) como agente complexante de metais. Sunda & Lewis (1978) relataram que mais de 99 % do Cu em água filtrada (< 0,45 µm) do Rio Newport encontrava-se complexado, e que após tratamento com ultra-violeta (UV), apenas um mínimo de Cu continuou complexado, provavelmente a carbonatos e hidroxo-complexos. O estudo demonstrou a natureza orgânica dos ligantes dissolvidos. Gächter et al. (1978) relataram que em águas naturais cerca de 70 % do Cu encontrava- se presente entre as frações dissolvidas (< 0,45 µm) e não ultrafiltradas (> 1000 Da), confirmando as macromoléculas orgânicas como as responsáveis pela complexação. Vários outros trabalhos mostraram que em lagos, uma grande fração (> 90 %) do Cu dissolvido encontrava-se complexado a ligantes orgânicos (Xue & Sigg, 1993; Achterberg et al. 2002). Ubíqua nos ambientes aquáticos, a MOD encontra-se presente em concentrações da ordem de 1 a 15 mg C L-1. Geralmente, ácidos húmicos e fúlvicos são os constituintes da MOD presentes em maiores quantidades, principalmente quando são considerados os ambientes aquáticos dulcícolas. As substâncias húmicas constituem cerca de 50 a 80 % da MOD (Buffle, 1988). O tamanho destes compostos, considerados de difícil degradação, varia de pequenas moléculas (< 1000 Da) a macromoléculas (> 100.000 Da), com uma grande variedade de grupos funcionais que contêm oxigênio, como ácidos carboxílicos e grupos fenólicos em maioria, mas também em menor quantidade grupos sulfidrila, aminas e outros (Campbell et al. 1997). Rijstenbil & Gerringa (2002) sugerem que os ligantes orgânicos para metais incluem exudatos algais e produtos da biodegradação de várias origens, como também compostos sintéticos, como aqueles oriundos de efluentes industriais. Alguns trabalhos propõem origem mais recente aos agentes complexantes de metais na coluna d’água. Bruland et al. (1991) citam que a concentração de ligantes para muitos metais é maior na zona eufótica do mar aberto e decresce até níveis não detectáveis em águas profundas. Os autores concluem que tal distribuição dos ligantes nos oceanos indica a origem biológica recente ao invés de compostos refratários. Outros autores mostraram que altas concentrações de ligantes coincidiram com máximos de clorofila no Mar de Sargasso, sugerindo a produção fitoplanctônica como 22 fonte dos agentes complexantes de Cu (Moffett, 1995). Xue & Sigg (1993) concluíram que os ligantes para Cu presentes no lago eutrófico Greifen foram produzidos por algas, pois os autores encontraram que as concentrações iônicas de Cu foram baixas durante o crescimento excessivo de algas na primavera, e altas no inverno. Dessa maneira, Xue e Sigg mostraram que a concentração de Cu iônico obedeceu um padrão sazonal similar ao da produtividade algal. Achterberg et al. (1997) acharam a maior concentração de ligantes naturais dissolvidos para o Cu durante um período de crescimento excessivo do fitoplâncton no lago Esthwaite Water, reforçando a importância dos materiais algais (exudatos e produtos de decomposição) na complexação deste metal. Em particular, estudos da interação dos produtos fitoplanctônicos com metais- traço em sistemas aquáticos naturais são de grande interesse devido ao papel do fitoplâncton como a base de cadeias alimentares (Kozarac et al. 1989). Além disso, sabe-se que células fitoplanctônicas liberam grande quantidade de materiais orgânicos ao ambiente (Vieira & Myklestad, 1986; Myklestad, 1995). Os materiais orgânicos das células algais são produtos finais originados da atividade fotossintética. A liberação destes materiais para o ambiente pode ocorrer por diferentes processos, entre eles a morte celular e consequente autólise das células ou lise por parasitas intra e extracelulares, o ‘grazing’ e quebra mecânica pelo zooplâncton, e ainda a excreção celular, por células saudáveis ou não (Fogg, 1977, 1983; Sharp, 1977; Aaronson, 1978; Mague et al. 1980). A excreção do carbono fotoassimilado para o meio aquático é considerada um processo natural e comum entre as algas, podendo representar de 1 a 95 % da fotossíntese líquida (Fogg, 1983). Esta variação depende da disponibilidade de nutrientes, fatores físico-químicos como irradiação e temperatura, diferenças inter- específicas e condições fisiológicas das células (Hellebust, 1965; Vieira, 1982; Vieira & Teixeira, 1982; Vieira & Myklestad, 1986; Cáceres & Vieira, 1988). Uma ampla variedade de moléculas biológicas constitui os produtos de excreção das células algais, como proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e carboidratos (Fogg, 1983). Entretanto, materiais de alta massa molecular, como os polissacarídeos, compõem a maior parte da excreção total de materiais orgânicos (Vieira & Myklestad, 1986; Myklestad, 1995). O papel ecológico e fisiológico dos polissacarídeos excretados por microalgas é bastante especulado. Várias funções têm sido propostas, como a utilização dos polissacarídeos como fonte de energia por microrganismos heterotróficos (Fogg, 1983), efeitos na coevolução de comunidades microbianas complexas (Wood & van Valen, 23 1990), interferência na troca de substâncias com o meio, como por exemplo captura de nutrientes e associações com íons metálicos (Brook, 1981; Lombardi & Vieira, 1999, 2000). Além disso, têm sido propostas as funções de redução das taxas de afundamento devido às cápsulas e bainhas extracelulares (Hutchinson, 1967; Walsby & Reynolds, 1980), que também dificultariam a predação por organismos zooplanctônicos (Porter, 1973; Reynolds, 1984), promoveriam condições favoráveis para a manutenção da atividade de determinadas enzimas (Spijkerman & Coesel, 1998), além da participação na formação de agregados gelatinosos (Leppard, 1995; Grossart & Simon, 1993; Grossart et al. 1997). Materiais de alta massa molecular (MAMM), em grande parte polissacarídeos excretados por microalgas de água doce e marinhas, foram caracterizados e quantificados (Lupescu et al. 1991; Paulsen & Vieira, 1994; Vieira & Paulsen, 1994; Vieira et al. 1994; Huang et al. 1998; Nicolaus et al. 1999; Gouvêa et al. 2000). Estima-se que a complexação com metais ocorra através das interações de cargas negativas de grupos aniônicos presentes nas macromoléculas (Manzini et al. 1984), tais como os grupos carboxila presentes nos polissacarídeos com cátions tais como o Cu no meio aquático (Leppard, 1995). Estudos da complexação dos MAMM com cátions divalentes como o Cu sugerem que ambos, o metal e os MAMM, têm os mesmos destinos no ambiente aquático enquanto durar esta associação (Kaplan et al. 1988; Lombardi & Vieira, 1998, 1999, 2000). Ainda, os MAMM podem contribuir significativamente ao conteúdo de carbono orgânico dissolvido (COD) local, particularmente no fim do crescimento excessivo do fitoplâncton (Mopper et al. 1995). Para tanto, cultivos em laboratório auxiliam no estabelecimento da importância de associações entre metais e excretados de microalgas e sua contribuição para a especiação de metais em águas naturais (Rijstenbil & Gerringa, 2002). Trabalhos sobre a comunidade fitoplanctônica do reservatório de Barra Bonita têm demonstrado a dominância de algumas microalgas, principalmente representadas pelos gêneros Microcystis aeruginosa, Anabaena spiroides e Aulacoseira granulata, comumente em crescimento excessivo neste reservatório eutrofizado (Calijuri & Dos Santos, 1996; Jati, 1998). Baseando-se nas considerações apresentadas anteriormente, é estimado que a especiação e complexação de metais na água do reservatório de Barra Bonita sofra grande influência de espécies fitoplanctônicas dominantes, através da produção e excreção de materiais orgânicos que atuariam como ligantes de metais. 24 2) HIPÓTESES E OBJETIVOS A hipótese deste trabalho está centrada no potencial dos materiais de alta massa molecular excretados por microalgas dominantes no reservatório de Barra Bonita atuarem como ligantes e influenciadores da especiação de íons metálicos na coluna d’água. Em complemento à hipótese, o trabalho abordou também o estudo da complexação e especiação de metais na água do reservatório de Barra Bonita. Este trabalho teve como objetivo principal o estudo da complexação de metais com os materiais excretados por espécies dominantes no reservatório eutrofizado de Barra Bonita. É esperado que estes compostos orgânicos atuem como ligantes para metais, tanto no microhabitat próximo às células, quanto no restante da coluna d’água. Assim, os compostos orgânicos excretados pelas microalgas influenciariam a especiação, biodisponibilidade, mobilidade e toxicidade dos metais presentes nestes ambientes, além de representarem potenciais contribuidores para a carga local de matéria orgânica. Cabe ressaltar que o enfoque na fração de alta massa molecular (MAMM) se deve ao fato da mesma ser considerada como a maior parte na excreção de compostos orgânicos pelo fitoplâncton. Para tanto, os objetivos específicos deste trabalho foram: i- Fazer um levantamento da especiação dos metais previamente selecionados (Cu e Cd), assim como a complexação destes com compostos dissolvidos na água do reservatório, em investigações de campo sazonais durante um período de dois anos. As seguintes determinações foram feitas: i.a- determinação das concentrações totais, iônicas e associadas à matéria orgânica na fração dissolvida (< 0,45 µm); i.b- determinação dos parâmetros de complexação dos metais com os ligantes presentes na fração dissolvida, quando houver associação; i.c- quantificação do carbono orgânico dissolvido e de parâmetros físico- químicos da coluna d’água. ii- Estudar a associação dos metais selecionados com os materiais de alta massa molecular (MAMM) excretados por três espécies oriundas do reservatório e consideradas como dominantes na comunidade fitoplanctônica local, envolvendo: ii.a- cultivo unialgal ou axênico das espécies selecionadas e análise das curvas de crescimento; 25 ii.b- obtenção dos materiais de alta massa molecular na fase estacionária do cultivo; ii.c- determinação dos parâmetros de complexação dos MAMM com os metais selecionados; ii.d- análises da composição monossacarídica e das proporções dos elementos C, H, N e S dos MAMM. Da maneira acima exposta, pretendeu-se avaliar o potencial de complexação dos MAMM de microalgas dominantes no fitoplâncton do reservatório, comparando a especiação dos metais e a complexação com os ligantes presentes na água do reservatório, para então ser possível inferir sobre a contribuição destes materiais para o destino de metais no reservatório. 26 3) METODOLOGIA 3.1) Área de estudo As amostras de campo e as microalgas do estudo de laboratório deste trabalho foram coletadas em um ponto amostral do reservatório eutrófico de Barra Bonita (Figura 2), localizado em 22º 32’ 34,5” S e 48º 29’ 26,4” W, a cerca de 3 km da barragem da usina hidrelétrica de Barra Bonita. Na Tabela 2 (Straškraba & Tundisi, 2000; CETESB, 2002) são apresentadas as características principais deste reservatório que é o primeiro de uma série de reservatórios artificiais do Rio Tietê. O reservatório foi construído em 1963 com o intuito principal de geração de energia elétrica para uma área de alta densidade populacional e industrializada do estado de São Paulo. Usos secundários incluem o suprimento de água, agricultura, irrigação, recreação e navegação. A descarga de efluentes domésticos e industriais recebida através dos tributários do reservatório influencia os níveis de contaminantes químicos, como também de material orgânico alóctone e autóctone gerado pela produção primária. Altos níveis de nutrientes, uma das características deste reservatório, têm favorecido o crescimento intenso do fitoplâncton. A comunidade fitoplanctônica é dominada por algumas poucas espécies, como as cianofíceas Microcystis aeruginosa e Anabaena spiroides e a diatomácea Aulacoseira granulata, as quais são comumente dominantes, apresentando crescimento excessivo (Calijuri & Dos Santos, 1996; Jati, 1998). Portanto, é previsto que o material orgânico produzido por estes organismos contribua significativamente à carga local de MOD (Gouvêa et al. 2004). O clima da região onde localiza-se o reservatório é caracterizado pela transição entre tropical e subtropical, com o mês de janeiro como o mais quente (temperatura média ≅ 27 ºC) e julho como o mais frio (≅ 18 ºC); porém, não há grandes diferenças entre estações a não ser pela estação chuvosa no verão e estação seca de inverno (Calijuri & Dos Santos, 2001). Os rios Tietê e Piracicaba são os principais formadores e influenciadores da qualidade da água do reservatório de Barra Bonita. O Rio Tietê tem o regime hídrico alterado de lótico para lêntico ao atingir o reservatório. Apesar do reservatório ser classificado como eutrófico, há um gradiente de melhora da qualidade da água ao longo do corpo central, o que reflete uma grande capacidade assimilativa, importante para a recuperação da qualidade da água (CETESB, 2002). 27 Figura 2. Reservatório de Barra Bonita, com o ponto de coleta das microalgas e de amostras de campo. Adaptado de Calijuri (1999). 28 Tabela 2. Características principais do reservatório de Barra Bonita. Adaptada de Straškraba & Tundisi, 2000 e CETESB, 2002. Bacia hidrográfica Rio Tietê Médio-Superior Coordenadas geográficas 22 º 29’S; 48º 34’W Área de drenagem da bacia hidrográfica 7.079 km2 Volume do reservatório 3,6 x 106 m3 Altitude 430 m Área superficial do reservatório 32.484 ha Profundidade máxima 25 m Profundidade média 10 m Comprimento 48 km Largura média 2 km Forma Vale do rio Faixa de flutuação anual do nível de água 5 m Tempo de retenção teórico 90 dias Classificação trófica Eutrófico 3.2) Espécies fitoplanctônicas. Isolamento e manutenção em laboratório As cianofíceas Microcystis aeruginosa (Kützing) Lemmermann, Anabaena spiroides Klebahn (Cyanophyta) e a diatomácea Aulacoseira granulata (Ehrenberg) Simonsen var. granulata (Heterokontophyta) foram selecionadas por representarem espécies fitoplanctônicas dominantes no reservatório. Após a coleta, no mesmo ponto da amostragem de campo, foi feito o isolamento por lavagem das células, com o uso de micropipetas e microscópio (Pringsheim, 1946). A diatomácea foi cultivada em meio WC (Guillard & Lorenzen, 1972) e as cianofíceas em meio ASM-1 (Gorham et al. 1964). As condições de cultivo estão resumidas na Tabela 3. As espécies são mantidas na coleção de culturas de microalgas de água doce do laboratório de Ficologia da Universidade Federal de São Carlos (SP, Brasil). Foram obtidas culturas axênicas de A. granulata segundo o método desenvolvido por Vieira (1983), com o uso de 0,5 % v/v de solução de Dakin em meio WC. O estado axênico foi testado com repicagens em tubos contendo o meio WC adicionado de peptona e glicose para revelação de contaminação por bactérias e fungos. Somente cultivos unialgais das cianofíceas foram usados devido à impossibilidade de axenização destas espécies durante o desenvolvimento deste trabalho e pelo método citado. 29 Tabela 3. Condições de cultivo das microalgas estudadas em laboratório. Fotoperíodo 12:12h (lâmpadas fluorescentes de 40 W) Intensidade luminosa 265 µmol m-2 s-1 Temperatura 20 - 22 ºC pH 6,8 – 7,0 A diatomácea A. granulata pertence à divisão Heterokontophyta, classe Bacillariophyceae e ordem Centrales. As células são cilíndricas, mais longas do que largas e se aderem umas às outras pela superfície valvar (de frústula de sílica), sendo organizadas em filamentos longos, simples e unisseriais (Bourrely, 1968). É uma espécie planctônica, considerada importante em lagos. As células não têm mecanismo de flutuação e sua posição na coluna d’água depende tanto da taxa de afundamento quanto da resuspensão por movimentos verticais causados por ventos e correntes. M. aeruginosa pertence à divisão Cyanophyta, classe Cyanophyceae e ordem Chroococcales. É uma espécie colonial, com um número grande de células esféricas que se dividem irregularmente e ficam envoltas em mucilagem. As populações se tornam abundantes principalmente no verão, formando acúmulos na superfície de lagos e poças devido à presença de vacúolos de gás capazes de regular a posição das colônias na coluna d’água (van den Hoek et al. 1995). Esta espécie tem importância sanitária devido ao potencial de formação de ‘blooms’ tóxicos, sendo a microcistina a toxina mais comumente produzida (Orr & Jones, 1996). A. spiroides é outra cianoficea (divisão Cyanophyta, classe Cyanophyceae), que pertence à ordem Nostocales. As células são dispostas em tricomas (filamento + bainha de mucilagem) simples e unisseriais, e unidas por uma constricção entre elas, tornando o aspecto do filamento, que pode ser curvado ou espiralado, como um colar de pérolas (van den Hoek et al. 1995). Os heterocistos e acinetos são células diferenciadas que têm as funções de capacidade de fixação de N2 e de esporo de resistência, respectivamente. As populações são encontradas em águas doces na maioria dos casos, e podem causar ‘blooms’ superficiais, devido à presença de vacúolos de gases. Também é uma espécie capaz de produzir toxinas. 30 3.3) Seleção dos metais estudados Foi feita uma análise prévia (n = 1) da concentração total dissolvida (filtro de acetato de celulose Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha, 0,45 µm de diâmetro de poro) de dez metais-traço, selecionados devido à importância nutricional ou tóxica, de água coletada a 1 m de profundidade no ponto amostral em 26/07/2000. As amostras tiveram pH ajustado para 2 com HNO3 ultrapuro e foram conservadas a 4º C até a análise. A digestão foi feita em capela, com HNO3 concentrado e as concentrações dos metais (Tabela 4) foram determinadas no Centro de Caracterização de Materiais (CCDM) da UFSCar, por espectrometria de absorção atômica (AAS - Varian Spectr aa220). Destes metais, foram selecionados o Cu e o Cd em razão de: i. estarem presentes no reservatório em concentrações totais dissolvidas que, segundo os padrões de qualidade de água da Legislação Federal (CONAMA 20/86) para as classes de uso das águas, estão em torno dos limites máximos para a classe 1 no caso do Cu (3,2 x 10-7 M), e excedem os valores máximos para as classes 1, 2 e 3 (8,9 x 10-9 M, 8,9 x 10-9 M e 8,9 x 10-8 M, respectivamente) no caso do Cd; ii. terem comportamentos distintos de afinidade por materiais orgânicos e inorgânicos dissolvidos na coluna d’água. Em águas naturais o Cu geralmente encontra- se associado à matéria orgânica, enquanto o Cd, com menor afinidade pelos materiais orgânicos, tende a ser encontrado na forma livre ou associado a complexos lábeis inorgânicos (HCO3 -, SO4 2-, Cl-, Ca2+) (Florence, 1977, 1986; Buffle & DeVitre, 1993). iii. serem tóxicos para a biota, dependendo da concentração e da especiação físico-química. O íon Cu2+ pertence ao grupo II, dos metais de transição, caracterizado por ter afinidade a sítios de ligação tanto fracos como fortes, e portanto reagir com sítios contendo oxigênio como doador de elétrons, assim como sítios carboxílicos e fenólicos, e mesmo sítios fracos que contêm N e S. (Buffle & DeVitre, 1993). É classificado como micronutriente por ser constituinte de sítios de atividade de algumas enzimas, mas torna-se tóxico em concentrações elevadas, causando, por exemplo, turgidez excessiva e lise das células fitoplanctônicas (Simkiss, 1979; Rijstenbil & Gerringa, 2002). A poluição ambiental por Cu tem como origens as indústrias de mineração, fundição e refinação, tal como a precipitação atmosférica causada por elas, efluentes de esgotos domésticos, algicidas, fungicidas e pesticidas (CETESB, 2003). 31 O Cd2+ pertence ao grupo III dos metais, com associação predominante em sítios relativamente fracos, por exemplo, os que contêm S como doador de elétrons. Não foi ainda descoberta alguma função em sistemas biológicos para este metal (Stokes, 1983), e efeitos tóxicos ao fitoplâncton já foram demonstrados (Rachlin et al. 1984). A contaminação ambiental por Cd é devido à queima de combustíveis fósseis, efluentes industriais e uso de inseticidas que o contém (CETESB, 2003). Tabela 4. Concentrações totais de dez metais presentes no reservatório em uma amostra (n =1) coletada em 26/07/2000, analisada no Centro de Caracterização de Materiais – UFSCar, por espectrometria de absorção atômica. Concentração Metais M mg L-1 Cr < 5,0 x10-7 < 0,026 Fe 1,1 x 10-6 0,060 Mn 6,6 x 10-7 0,036 Ni 1,9 x 10-7 0,011 Zn < 1,4 x 10-7 < 0,009 Pb < 5,1 x 10-7 < 0,106 Hg 5,6 x 10-7 0,112 Cd < 1,1 x 10-7 < 0,012 Cu < 3,9 x 10-7 < 0,025 Co < 2,9x 10-7 < 0,017 3.4) Estudo de campo 3.4.1) Coleta das amostras Coletas sazonais foram realizadas a cada 3 meses e por um período de 2 anos, entre março de 2001 a abril de 2003. A coleta de água para todas as análises foi feita a 1 m da superfície, na coluna fótica, e um ponto passível de representação da coluna d’água em situações de mistura ou desestratificação, como ocorre com frequência neste reservatório em estudos prévios (Barbosa et al. 1999; Calijuri & Dos Santos, 2001). A água do reservatório foi coletada conforme Mart (1979), em garrafa de van Dorn, construída com PVC e silicone. As amostras foram acondicionadas em 32 Erlenmeyers de policarbonato (PC) previamente lavados por imersão em solução ácida (HNO3 0,1 M, 10 dias). Como todas as análises compreenderam a fração dissolvida da água do reservatório, foi feita a filtração das amostras com filtros de acetato de celulose (0,45 µm Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha). Os filtros foram previamente imersos em HNO3 1 M por 24 h e lavados com 100 mL de água destilada (destilador em vidro) ou ultrapura para eliminar metais, carboidratos contaminantes e corrigir a acidez (Silva, 1996; Lombardi & Vieira, 1998). Portanto, a filtração foi feita em laboratório em seguida à coleta. Amostras para as análises de metais e COD foram transportadas e conservadas a ± 4 ºC, no escuro (Florence, 1977). As amostras para análise dos monossacarídeos foram preservadas em freezer (Mopper et al. 1995). 3.4.2) Variáveis físico-químicas Dados de pH, temperatura, oxigênio dissolvido, condutividade, potencial de óxido-redução, turbidez, sólidos totais dissolvidos e concentrações dos íons amônio, nitrato e cálcio foram coletados em intervalos de 2 m na coluna d’água, com um sistema de monitoramento da qualidade de água (Horiba U-23, Kyoto, Japão). A transparência da água foi medida com Disco de Secchi (ZDS). O perfil de irradiação na coluna d’água foi obtido com as medidas de irradiância (E, µmol m-2 s-1), em radiômetro (LI-1400, LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA) com sensor esférico de quantum (LI-190-AS). O coeficiente de extinção vertical (kd), que caracteriza a atenuação da luz na coluna d’água, foi estimado a partir da inclinação da reta de regressão linear da profundidade versus o lnE. A zona eufótica (Zeu) foi calculada com a equação (1) apresentada em Wetzel (1975): Zeu = ln (100) / kd. (1) O carbono orgânico dissolvido (COD) das amostras filtradas foi quantificado em um analisador de carbono orgânico total (TOC-5000A - Total Organic Carbon Analyzer – Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). A concentração de clorofila-a das amostras de fitoplâncton retido em filtro de acetato de celulose (0,45 µm de diâmetro do poro), foi determinada através de extração com acetona 90 % (24 h). Esta metodologia encontra-se descrita em Talling & Driver (1963). 33 3.4.3) Análise dos monossacarídeos de amostras da água do reservatório Os monossacarídeos neutros foram identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC –High Pressure Liquid Cromatography) com detector por pulso amperométrico (PAD ED-40) e coluna de separação PA-10 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA) seguindo-se a metodologia descrita por Wicks et al. (1991), Mopper et al. (1992) e Gremm & Kaplan (1997). Os monossacarídeos fucose, ramnose, arabinose, galactose, glicose, manose, xilose, frutose e ribose (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) foram usados na padronização. Manose e xilose apresentaram o mesmo tempo de retenção com a metodologia usada, e portanto a identificação e quantificação destes monossacarídeos foi feita em conjunto. Monossacarídeos ácidos e aminados não foram analisados devido às suas cargas. Estas os retêm no tratamento de dessalinização da amostra. Amostras de campo filtradas (0,45 µm) foram submetidas à hidrólise e dessalinização para obtenção dos monossacarídeos neutros totais, enquanto os monossacarídeos livres foram analisados em amostras filtradas mas não hidrolisadas. A dessalinização foi feita com resinas aniônica (AG 2-X8 20-50 mesh chloride form, BioRad, Hercules, CA, USA) e catiônica (AG 50W-X8 50-100 mesh hydrogen form, BioRad). A hidrólise foi feita após adição de 150 µL de HCl em 5 mL de amostra e aquecimento em estufa a 100 ºC por 12 h. 3.4.4) Análises dos metais Todas as análises, incluindo as titulações complexométricas, foram feitas com temperatura controlada (22 ± 2 ºC) e força iônica (I) ajustada para 0,1 M com NaNO3 (MicroSelect, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Suíça). Para minimizar os efeitos da adsorção dos metais nos recipientes, foram usados recipientes plásticos e de policarbonato (PC), com exceção das celas polarográficas (vidro). Todos os recipientes foram lavados por imersão em HNO3 analítico 1 M, e as celas polarográficas com HNO3 6 M. O uso de água destilada em destilador de vidro foi posteriormente substituído pelo uso de água ultrapura (início de 2002) com condutividade 18 Ω (Barnstead International, Dubuque, Iowa, USA) tanto para as lavagens quanto para a confecção de brancos das determinações de metais. Os recipientes foram lavados no momento de uso, ou então foram secados em estufa e embalados em sacos plásticos para evitar contaminação. Os padrões concentrados de Cu (1mg mL-1 CuCl2, Titrisol®, 34 Merck, Whitehouse Station, New Jersey, EUA) e Cd (1mg mL-1 Cd (NO3)2 ⋅ 4H2O, Carlo Erba reagenti, Milão, Itália) foram conservados a 4º C e preparados por diluição serial em concentrações apropriadas para as titulações. 3.4.4.1) Especiação de Cu e Cd na água do reservatório A proposta de estudo da especiação química dos metais Cu e Cd é apresentada na Figura 3. O metal iônico (M+) foi determinado por potenciometria com eletrodos seletivos (ISE) aos íons Cu2+ (ATI ORION, modelo 94-29, Boston, MA, EUA) ou Cd2+ (ATI ORION 9448), em conjunto com eletrodo de referência Ag/AgCl de dupla-junção (ATI ORION 90-02). Os potenciais foram obtidos com um medidor de pH/ISE (ATI ORION 710A), em pH natural mantido com 7,5 x 10-3 M de tampão PIPES (Piperazina – N, N’ – bis [2 – ácido etanosulfônico], Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Curvas de calibração dos eletrodos foram feitas em pH 5,0 para assegurar que todo o metal encontrava-se na forma iônica. Soluções de tampão metálico foram feitas com o uso de Cu (ou Cd), NTA (ácido nitrilo-triacético) e bórax (H3BO3) para estender os limites de detecção das curvas de calibração para 2,0 x 10–13 M de Cu e 1,4 x 10-10 M de Cd (Jardim et al. 1986). Informações adicionais relacionadas a tampões metálicos e limites de detecção para ISE são apresentadas em Lombardi & Vieira (2000). Foi feita uma regressão linear dos pontos da calibração para a obtenção da fórmula de cálculo da concentração de metal iônico a partir das leituras em mV e também para verificar o comportamento Nernstiano, que ocorre com coeficiente angular da reta de valor entre 25 - 30 º. A descrição e teoria da equação de Nernst e cálculos citados acima são encontrados em Covington (1984) e Evans (1987). Curvas de calibração para Cd e Cu estão exemplificadas nas Figuras 4 e 5. As concentrações de metal total (Mtot), metal associado à matéria orgânica (MMO) e metal lábil (Mláb) foram determinadas por voltametria de redissolução anódica com pulso diferencial (DPASV) em polarógrafo com eletrodo de mercúrio gotejante (EG & G Eletrochemical Trace Analyzer, modelo 394, eletrodos modelo 303A Princeton Applied Research, Princeton, New Jersey, EUA). Os parâmetros usados são descritos na Tabela 5. O limite de detecção foi calculado segundo Poldoski & Glass (1978), correspondente a duas vezes a média dos erros-padrão para duas análises distintas com baixa concentração de metais. 35 Figura 3. Esquema de especiação dos metais Cu e Cd para a água filtrada (0,45 µm) do reservatório. ISE = eletrodos íon-seletivos. DPASV = voltametria de redissolução anódica. Água de Barra Bonita f iltrada (0,45 µm) Metal iônico (M + ) ; ISE Metal total (Mtot ) ; DPA SV Metal lábil (M láb ); DPASV Metal associado à matéria orgânica (M MO ); DPASV Metal associado à matéria inorg ânica (MI = Mtot – M MO) 36 Figura 4. Curva de calibração para o eletrodo íon seletivo de Cd. Eletrodo de referência: Ag/AgCl. Figura 5. Curva de calibração para o eletrodo íon-seletivo de Cu. Eletrodo de referência: Ag/AgCl. -10 -9 -8 -7 -6 -5 -340 -320 -300 -280 -260 -240 -220 -200 Cd Y = -75,78629 + 26,5441 * X R = 0,99 Co rre nt e (m V ) log Cd2+ (M) -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -50 0 50 100 150 Cu Y = 263,54668 + 25,143 * X R = 0,99 Co rre nt e (m V ) log Cu2+ (M) 37 Tabela 5. Parâmetros para a determinação dos metais cobre e cádmio por DPASV. Tempo de deposição 200 s Tempo de equilíbrio 30 s Potencial inicial (ou de deposição) -0,9 V Potencial final 0 V Pulso (altura) 25 mV Varredura 6,67 mV s-1 Eletrodo de referência AgCl Eletrodo de trabalho HMDE Tamanho da gota Médio Gás de purga Nitrogênio P. A. Tempo de purga (entre leituras) 30 s Tempo de purga inicial (para a amostra) 16 min O metal lábil (Mláb), que compreende as espécies iônicas e os complexos fracos, foi analisado segundo a metodologia de adição de padrão interno de Ostapczuk et al. (1987), com uso de tampão PIPES (7,5 X 10-3 M) para manter o pH ajustado em 6,8- 6,9. A quantificação do metal total (Mtot) foi feita em pH ≅ 2,0, sem tampão, e também por adição de padrão interno, após acidificação da amostra com HNO3 2 M ultrapuro (TraceSelect, Fluka Biochemika) e fervura por 5 minutos (Batley & Florence, 1976). O metal associado à matéria orgânica (MMO) foi quantificado após a fotodegradação desta em um reator (Campos et al. 2001) através de luz ultravioleta (UV). Testes de tempo de exposição da água de Barra Bonita (filtrada) à luz UV no reator (Tabela 6), com quantificação prévia e posterior das concentrações de carbono orgânico (descrição no item 3.4.2), confirmaram a destruição da matéria orgânica em 6 h, ou então em 4 h adicionando-se H2O2 (grau analítico, Merck) em concentração final de 10 mM, como catalisador da fotodegradação. Para assegurar a fotodegradação em amostras com concentrações distintas de COD, foi padronizada a exposição das amostras ao reator por 8 h. A eficiência da exposição ao UV por 8 h foi confirmada por análises de fluorescência (Campos et al. 2001). Leituras da intensidade de fluorescência 38 de emissão das amostras foram feitas usando-se um espectrofluorímetro (FP 6500, Jasco Corporation, Tokyo, Japão). As leituras foram feitas em cubetas com caminho óptico de 1 cm, em comprimento de onda excitação de 313 nm e varredura de emissão de 330 a 600 nm, e larguras da fenda de excitação e de emissão de 10 e 2,5 mm, respectivamente. O pico de 416 nm (Tabela 7), de amostras antes da exposição ao UV, não foi detectado após a exposição, comprovando a quebra do COD representada por este pico. Tabela 6. Teste de destruição da matéria orgânica presente na amostra filtrada do reservatório usando-se o reator de fotodegradação. Temperatura interna do reator ≅ 50 ºC. Tempo de exposição (h) Água sem H2O2, COD (mg L-1) Água com 10 µM H2O2, COD (mg L-1) Perda de vol. por evaporação (mL) Inicial 9,2 9,2 - 2 5,7 3,8 0,4 4 4,9 0 0,3 6 0 0 0,2 Tabela 7. Teste de fotodegradação da matéria orgânica em 8 h de exposição ao reator de fotodegradação. Leituras de fluorescência em λ excitação = 313 nm e λ emissão = 330 - 600 nm. Testes Pico, nm Intensidade de fluorescência Água, B. Bonita, filtrada 416,1 (±0,1) 527,4 (±3,5) Água B. Bonita após reator 416,1 (±0,1) - -: não detectado A concentração de metais associados a materiais inorgânicos (MI) constou de estimativa indireta pelo cálculo da equação (2). MI = Mtot – MMO (2) Como exercício inter-laboratorial, determinações de Cutot dissolvido foram também realizadas no laboratório de Química Ambiental (UFPR – Curitiba, PR). Assim, em uma coleta realizada em março de 2003, foram determinadas as concentrações de Cutot dissolvido, além de Culáb e Cutot recuperável, duas espécies não 39 analisadas anteriormente para as coletas sazonais. O Culáb, que é a soma das concentrações iônicas e de complexos de fraca associação, foi determinado em amostras filtradas e com pH natural, por DPASV e com a adição de ligante competitivo (Xue & Sigg, 1998). Alíquotas não filtradas e filtradas destinadas às análises respectivas de Cutot recuperável e Cutot dissolvido foram acidificadas até pH ≅ 2,0 com HNO3 ultrapuro. A quebra da matéria orgânica das amostras foi feita em um reator de quartzo, constituído de um tubo interno de quartzo envolto por uma câmara de vapor de mercúrio, que é ativada em microondas para emissão de UV. Após a exposição de amostras filtradas e acidificadas ao reator, foi adicionado o ligante etilenodiamina. Depois de 12 h de equilíbrio, foi feita a determinação da corrente ip máx. (pico referente ao complexo etilenodiamina-Cu), e da concentração de Cutot a que ela equivale através de adição de padrão. Em seguida, medidas de Culáb de amostras filtradas foram feitas com a adição de etilenodiamina segundos antes do término da fase de deposição, em DPASV. Através da corrente resultante (ip 0) o Culáb foi calculado, após a divisão do ip máx. (da leitura do Cutot) e a multiplicação pelo valor de Cu (ip máx. correspondente). O Cutot recuperável é o conjunto de íons liberados após a redução do pH da amostra para ≅ 2,0 e exposição ao reator de UV, e portanto representou a fração recuperada após este procedimento de digestão, ou seja, a soma do Cutot dissolvido e do Cu particulado recuperável. Esta determinação foi feita por DPASV, com adição de padrão interno e força iônica ajustada para 0,1 M com NaNO3. O Cu recuperável proveniente da fase particulada foi calculado indiretamente pela equação (3): Cu recuperável particulado = Cutot recuperável – Cutot dissolvido (3) 3.4.4.2) Capacidade de complexação da água do reservatório com Cu e Cd Neste trabalho, os parâmetros de complexação de metais, constante de estabilidade condicional (K’) e concentração de ligantes (CL), foram determinados por ISE. Esta técnica tem a vantagem de medir diretamente o metal iônico, que é considerado uma das espécies mais tóxicas ao plâncton. Titulações com o emprego de ISE são indicadas para águas naturais que apresentam altas concentrações de agentes complexantes, devido à relativamente baixa sensibilidade na medição de metais (Neubecker & Allen, 1983). Os limites de detecção de Cu e Cd por ISE foram estendidos com o uso de tampão metálico (descrição em 3.4.4.1). Titulações de amostras de água do reservatório com Cu e Cd foram feitas em tréplicas. O pH foi 40 mantido entre 6,8-6,9 com 7,5 x 10-3 M de PIPES. Tempos de equilíbrio para as leituras foram determinados de acordo com a resposta dos eletrodos. Para a primeira adição de metal, um tempo de 4 h foi requerido. No entanto, os tempos de equilíbrio decresceram com o aumento das concentrações totais durante a titulação. Foram feitas 15 adições de metal, com concentrações entre 5,0 x 10–7 M e 1,0 x 10–5 M. Curvas de calibração diárias foram feitas como descrito na seção 3.4.4.1. Os parâmetros de complexação foram calculados com a utilização de análises gráficas descritas por Scatchard et al. (1957). Titulações de branco dos eletrólitos, com as mesmas concentrações dos metais, do tampão e do ajustor de força iônica, resultaram na não complexação dos metais estudados. Comparações entre os parâmetros de complexação obtidos para amostras de água do reservatório foram feitas por ANOVA paramétrica e teste t de Student (Graphpad Instat v 2.01, San Diego, CA, EUA). Em adição à obtenção de CL por ISE, a capacidade de complexação aparente (ccap) foi determinada por DPASV. Esta técnica consiste da determinação do metal lábil após um número de adições internas de metal iônico ter se equilibrado com os ligantes presentes na amostra. O intervalo de adições de metal para esta análise foi de 5,0 x 10-7 M a 9,0 x 10-7 M. A capacidade de complexação é igual ao intercepto na abscissa em um gráfico no qual o eixo Y apresenta a corrente do pico (µA) e o eixo X a concentração do metal iônico adicionado. O intercepto na abscissa é calculado a partir da linha de regressão pelo método dos mínimos quadrados de Y em X, onde Y = 0 (Chau et al. 1974). A verificação da ocorrência de complexação é feita com comparação da inclinação da reta de regressão, em análises de brancos dos eletrólitos. A complexação em uma amostra ocorre se a inclinação obtida tiver valor inferior à do branco. A capacidade de complexação, medida por DPASV, é considerada aparente pois ocorre subestimação da complexação devido à detecção do metal iônico mais as espécies lábeis e complexos que se dissociam com a aplicação da corrente (Morrison & Florence, 1989). 3.4.4.3) Modelagem dos dados de especiação As concentrações de Cu2+ e Cd2+ dissolvidos foram estimadas pelo modelo de equilíbrio químico MINEQL+ (Versão 4.5, Environmental Research Software, Hallowell, ME, EUA). O intuito desta estimativa foi o de comparar as concentrações iônicas obtidas por ISE com aquelas estimadas pela modelagem. Para tanto, foram utilizados os parâmetros de complexação K’ e CL dos metais com ligantes da água do 41 reservatório, obtidos neste trabalho. Na modelagem, a composição da água do reservatório teve os valores médios das 8 coletas sazonais tanto para os parâmetros de complexação log K’ e CL da classe de ligantes 1 para Cu, quanto para as concentrações totais de Cu e Cd, obtidas neste trabalho por DPASV. Também foram adicionadas à modelagem as concentrações totais dissolvidas dos seguintes íons, considerados como principais em águas doces (Wetzel, 1975; Mylon et al. 2003): Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO4 2- (Oliveira, 1993), NH4 + (Barbosa et al. 1999), NO3 - e PO4 3- (CETESB, 2003). 3.5) Estudo de laboratório 3.5.1) Curvas de crescimento das microalgas A curva de crescimento de cada espécie foi obtida com a montagem de culturas do tipo ‘batch’ em garrafões com capacidade de 8 L com 7 L de meio de cultura e inóculo na fase exponencial de crescimento. Estas culturas também foram usadas para a obtenção dos MAMM excretados, ao final da fase exponencial. As condições de cultivo foram as mesmas da Tabela 3, com aeração dos garrafões por borbulhamento de ar filtrado e umedecido em água acidificada (pH ≅ 3,0) e autoclavada. Amostras periódicas para análises de clorofila-a e número de células foram retiradas em condições axênicas em fluxo laminar, após exposição dos frascos de cultura à luz UV por 30 minutos. As contagens de células foram feitas em hemocitômetro Fuchs-Rosenthal, e microscópio óptico (400 x), exceto para A. spiroides, feitas em câmara de sedimentação de altura de 6 mm e microscópio invertido (Ros, 1979). A contagem nesta câmara foi mais apropriada para A. spiroides pois houve a possibilidade de divisão da câmara em campos, já que os filamentos desta espécies são longos o bastante para ultrapassarem um campo de contagem. Portanto, foi padronizada a contagem de até 30 tricomas, para estabilização do número de campos. O número de células por mL foi obtido através da equação (4). N = n x 1000 x 106 / Ac x h x Nc onde: N = densidade fitoplanctônica (indivíduos mL-1); Ac = área do campo de contagem; h = altura da câmara de sedimentação; Nc = nº de campos contados (4) A concentração de clorofila-a (mg L-1) foi analisada em células retidas em filtros de acetato de celulose (diâmetro do poro 0,45 µm), a partir de volumes amostrados entre 5 - 20 mL (Talling & Driver, 1963). 42 A taxa específica de crescimento (µ) foi estimada como a inclinação da reta de regressão linear do ln das concentrações de clorofila-a (mg L-1) na fase exponencial de crescimento em função do tempo (dias de cultivo). 3.5.2) Obtenção dos materiais de alta massa molecular das culturas e da água do reservatório Os materiais de alta massa molecular (MAMM) excretados pelas microalgas, nas culturas tipo ‘batch’, foram isolados entre o final da fase exponencial e início da fase estacionária de crescimento. Filtrados foram obtidos por filtração à vácuo (24 cm Hg) com unidades de filtração de polisulfona (PSF) e filtros de acetato de celulose (0,45 µm diâmetro de poro, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha), pré-lavados em 1 M HNO3 por 24 h e com 100 mL de água destilada em vidro no momento do uso. Os filtrados foram concentrados sob vácuo (Cole-Parmer Instrument, Chicago, Illinois, EUA), em rotaevaporador (Büchi, Switzerland) a 40 ºC. Em seguida, as amostras foram colocadas em tubos de diálise (Spectrapor, Spectrum Medical Industries, Los Angeles, California, EUA) com poros de exclusão de 12.000-14.000 Da, e dialisadas contra água destilada em vidro (48 h). Para prevenir o crescimento de bactérias, tolueno (0,1 % v/v) foi adicionado nos tubos de diálise. Os MAMM dissolvidos foram então liofilizados (Freeze Dryer 4.5, Labconco, Kansas City, Missouri, USA) a - 50 °C e preservados em freezer até as análises. O mesmo procedimento de separação do MAMM das culturas foi aplicado à água de Barra Bonita, amostrada de acordo com a seção 3.4.1. O pH desta água foi medido em campo, antes da coleta, com o sistema de monitoramento de qualidade de água (Horiba U-23 Kyoto, Japão). 3.5.3) Análises dos materiais de alta massa molecular das culturas e da água do reservatório Os materiais liofilizados (MAMM) foram usados secos para as análises dos monossacarídeos e dos elementos C, H, N e S, e para o restante das análises foram diluídos (50 µg mL-1) em água destilada em vidro. Para determinação dos parâmetros de complexação de metais com os excretados das 3 microalgas em conjunto, soluções da mistura destes MAMM foram utilizadas, e cada material adicionado proporcionalmente (16,6 µg de cada MAMM por mL). O conteúdo de carbono orgânico das soluções de MAMM foi analisado como descrito na seção 3.4.2. 43 3.5.3.1) Capacidade de complexação com Cu e Cd As titulações para obtenção dos parâmetros de complexação de Cu e Cd com os MAMM das microalgas, da água do reservatório e da mistura dos MAMM das microalgas foram feitas como descrito na seção 3.4.4.2. Estas titulações foram feitas em pH constante (6,8 ± 0,1) e similar ao pH das culturas de microalgas em laboratório, e da água do reservatório no dia da coleta. Os parâmetros de complexação foram comparados por ANOVA paramétrica e teste t de Student como descrito em 3.4.4.2. Os MAMM assim como as amostras sazonais do trabalho de campo não foram purificados para a retirada de metais possivelmente presentes nestes materiais. Deste modo, os parâmetros de complexação obtidos representam o potencial de complexação considerando-se os sítios de ligação para metais com exceção daqueles supostamente já ocupados pelos metais presentes. Em adição, titulações com os metais Cu e Cd foram feitas separadamente, e portanto, na obtenção dos parâmetros de complexação a competição entre estes metais pelos sítios de ligação não foi abordada no presente estudo. A ccap de Cu e Cd com os MAMM também foi determinada por DPASV, assim como na seção 3.4.4.2. 3.5.3.2) Composição monossacarídica Cromatografia a gás dos monossacarídeos que compõem os MAMM foi feita após metanólise de alíquotas de 1 mg do material liofilizado, com o uso de 1 M HCl em metanol a 80 ºC por 24 h, e posterior derivatização do material hidrolisado para O- metil-silil derivados de metil glicosídeos. A metodologia empregada é descrita em Reinhold (1972) e modificada por Paulsen & Vieira (1994). As amostras foram injetadas com microseringa previamente lavada com piridina, em um cromatógrafo HP5890 Series II (Hewlett-Packard Company, Analytical Products Group, Palo Alto, CA, EUA) equipado com uma coluna de sílica J&W DB-5 30-m. Manitol foi usado como padrão interno e a identificação e quantificação dos monossacarídeos foram feitas seguindo-se o tempo de retenção e curva de calibração dos padrões de fucose, galactose, glicose, manose, ramnose, xilose, ácido glicurônico, ácido galacturônico, N- acetil glicosamina e N-acetil galactosamina. 44 3.5.3.3) Proporção dos elementos C, H, N e S As proporções dos elementos C, H, N e S foram obtidas com um analisador elementar EA 1110 CHNS (CE Instruments, ThermoQuest, Rodano, Milan, Italy). Amostras de 2 a 3 mg dos materiais liofilizados (MAMM) foram pesadas em cadinhos de estanho (ThermoQuest, Rodano, Milão, Itália), em balança de precisão (AT21 Comparator balance, Mettler Toledo, Laboratory & Weighing Technologies, Greifensee, Suíça). Os cadinhos foram colocados no tambor de amostragem do aparelho, que os injetou em um forno onde a análise foi feita após o processo de combustão do tipo “dynamic flash” (Friis et al. 1998). A determinação das proporções foi obtida através de calibração com os padrões cistina, sulfanilamida, metionina e BBOT (ThermoQuest, Rodano, Milão, Itália). 3.5.3.4) Análise de fluorescência do material de alta massa molecular da água do reservatório O MAMM do reservatório foi avaliado quanto à sua fluorescência. Soluções com concentrações variadas deste material foram lidas em fluorímetro, como descrito na seção 3.4.4.1. Determinações de carbono orgânico total foram feitas para cada solução (procedimento na seção 2.1.2). A partir da construção dos gráficos i) concentração das soluções versus intensidade do pico obtido, ii) concentração das soluções versus carbono orgânico dissolvido e iii) carbono orgânico dissolvido versus intensidade de emissão de fluorescência, foi feita a regressão linear dos pontos para avaliar a relação entre estes parâmetros. 45 4) RESULTADOS 4.1) Estudo de campo 4.1.1) Parâmetros físico-químicos Os perfis dos parâmetros físico-químicos das 8 coletas sazonais entre março de 2001 e abril de 2003 estão apresentados nas Figuras 6 a 9. Os dados de profundidade do disco de Secchi, coeficiente de extinção vertical da luz, zona eufótica, zona máxima, conteúdo de clorofila-a e carbono orgânico dissolvido foram resumidos na Tabela 8 e um perfil de irradiação solar foi exemplificado na Figura 10. As coletas foram realizadas em geral entre às 11:00 pm e 12:00 pm. Condições ácidas de pH predominaram nas estações de verão e inverno, com valores mínimos de 5,4 a 5,5. Condições básicas com máximo de 7,5 a 8,9 predominaram nas coletas de outono e primavera. Uma tendência de aumento ou constância do pH foi observada em função da profundidade, sendo a principal variação entre 1 a 4 m de profundidade em até 1,6 unidades, e com a proximidade do sedimento (fundo) houve em geral um decréscimo dos valores, o que pode ser indício da ocorrência de respiração anaeróbia. A temperatura diminuiu na coluna d’água, na região próxima à superfície ou gradualmente com a profundidade. Os perfis de inverno e verão apresentaram menores variações de temperatura com a profundidade (até 2 ºC) e os perfis de outono e primavera apresentaram as maiores variações (até 5 ºC). Os valores oscilaram em torno de 20 a 22 ºC no inverno, 22 a 27 ºC na primavera, 25 a 27 ºC no verão e 24 a 30 ºC no outono. As concentrações de oxigênio dissolvido decresceram com a profundidade. A superfície da coluna d’água apresentou condições entre não-saturação a supersaturação, de 3 a 16 mg L-1, enquanto próximo ao sedimento as concentrações variaram entre 5 mg L-1 até valores muito próximos de zero nas coletas da primavera de 2002 e verão de 2003. 46 A B Figura 6. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas realizadas em 20/03/2001 – outono (A) e 09/07/2001 –inverno (B). 20 15 10 5 0 19 20 20 15 10 5 0 -10 0 10 20 20 15 10 5 0 2 4 6 8 20 15 10 5 0 28 30 NH4 + mg L-1Potencial de óxido-redução mV Total de sólidos dissolvidos mg L-1 Temperatura ºC Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 0,12 0,13 20 15 10 5 0 -150 0 150 20 15 10 5 0 0 4 8 20 15 10 5 0 6 12 18 24 20 15 10 5 0 2 4 6 8 Condutividade mS m-1 20 15 10 5 0 6,6 6,9 7,2 Ca2+ mg L-1NO3 - mg L-1 Turbidez NTUpH Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 6,4 6,8 7,2 Temperatura º C Turbidez NTU Condutividade mS m-1 Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 28 29 30 31 20 15 10 5 0 0 150 Ca2+ mg L-1NO3 - mg L-1NH4 + mg L-1Potencial de óxido redução mV Total de sólidos dissolvidos g L-1 20 15 10 5 0 5 6 7 8 9 20 15 10 5 0 20 21 Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 0,18 0,20 pH 20 15 10 5 0 -200 0 20 15 10 5 0 0 40 80 20 15 10 5 0 18 24 30 36 20 15 10 5 0 20 40 60 47 A B Figura 7. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas realizadas em 17/10/2001 – primavera (A) e 21/01/2002 – verão (B). 20 15 10 5 0 23 24 25 Temperatura ºC 20 15 10 5 0 37,2 37,8 Condutividade mS m-1 20 15 10 5 0 6 7 Pr of un di da de (m ) pH 20 15 10 5 0 0,24 0,26 Total de sólidos dissolvidos g L-1 20 15 10 5 0 3 4 5 6 7 8 Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 20 30 40 NH4 + mg L-1 20 15 10 5 0 30 40 50 NO3 - mg L-1 20 15 10 5 0 0,4 0,6 Ca2 + mg L-1 20 15 10 5 0 0 20 40 Turbidez NTU 20 15 10 5 0 -60 0 60 Potencial de óxido redução mV 20 15 10 5 0 6,0 6,4 pH Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 26,4 27,0 Condutividade mS m-1 20 15 10 5 0 0 20 40 Turbidez NTU 20 15 10 5 0 4 5 6 Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 25 26 27 Temperatura ºC 20 15 10 5 0 0,17 0,18 Total de sólidos dissolvidos g L-1 20 15 10 5 0 -150 0 150 Potencial de óxido-redução mV 20 15 10 5 0 80 160 NH4 + mg L-1 20 15 10 5 0 40 80 NO3 - mg L-1 20 15 10 5 0 1,6 1,8 Ca2 + mg L-1 48 A B Figura 8. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas de 25/06/2002 – inverno (A) e 14/10/2002 – primavera (B). 20 15 10 5 0 5,6 6,0 6,4 20 15 10 5 0 22 24 26 28 20 15 10 5 0 15 30 45 20 15 10 5 0 4,8 5,2 5,6 20 15 10 5 0 22,0 22,2 20 15 10 5 0 0 100200 Ca2 + mg L-1NO3 - mg L-1NH4 + mg L-1Potencial de óxido-redução mV Total de sólidos dissolvidos g L-1 Temperatura ºC Oxigênio dissolvido mg L-1 Turbidez NTU Condutividade mS m-1pH 20 15 10 5 0 0 1 20 15 10 5 0 80 160 20 15 10 5 0 0 30 60 20 15 10 5 0 0,4 0,8 Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 6,4 7,2 8,0 Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 37 38 39 20 15 10 5 0 80 100 20 15 10 5 0 0 4 8 12 20 15 10 5 0 22 24 26 Potencial de óxido-redução mV Total de sólidos dissolvidos g L-1 20 15 10 5 0 -150 0 150 20 15 10 5 0 0,24 0,28 Oxigênio dissolvido mg L-1 Temperatura ºC Turbidez NTU Condutividade mS m-1pH 20 15 10 5 0 60 80 100 NH4 + mg L-1 20 15 10 5 0 0,12 0,14 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 Ca2+ mg L-1NO3 - mg L-1 49 A B Figura 9. Perfis de variáveis físico-químicas das coletas de 13/01/2003 – verão (A) e 28/04/2003 – outono (B). 20 15 10 5 0 5,4 6,0 6,6 Ca2 + mg L-1NO3 - mg L-1 NH4 + mg L-1Potencial de óxido-redução mV Total de sólidos dissolvidos g L-1 Temperatura ºC Turbidez NTU Condutividade mS m-1pH 20 15 10 5 0 0 40 80 20 15 10 5 0 -8 0 20 15 10 5 0 0 2 4 20 15 10 5 0 27,0 27,3 20 15 10 5 0 0,0 0,3 0,6 Pr of un di da de (m ) 20 15 10 5 0 0 10 20 30 20 15 10 5 0 0,4 0,8 20 15 10 5 0 20 40 60 80 20 15 10 5 0 -0,8 0,0 0,8 Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 7 8 9 20 15 10 5 0 16,0 16,4 20 15 10 5 0 -10 0 10 20 Oxigênio dissolvido mg L-1 20 15 10 5 0 4 8 12 16 Temperatura º C 20 15 10 5 0 2425262728 Turbidez NTU Condutividade mS m-1pH Pr of un di da de (m ) 50 Tabela 8. Dados de transparência da água pelo disco de Secchi (ZDS), coeficiente de extinção vertical da luz (kd), zona eufótica (Zeu), profundidade máxima (Zmax), concentrações de clorofila-a e carbono orgânico dissolvido (COD) das coletas sazonais. Média ± erro da média. Coleta ZDS (m) kd (m-1) Zeu (m) Zmax (m) Clorofila (µg L-1) COD (mg L-1) 20/03/01 1,03 1,35 3,41 20 12 (± 0,4) 7,1 (± 2,1) 09/07/01 0,70 1,57 2,94 17 22 (± 0,6) 5,8(± 0,1) 17/10/01 0,93 1,91 2,41 17 46 (± 2,0) 6,7(± 0,1) 21/01/02 1,26 * * 19 13 (± 1,0) 2,7(± 0,1) 25/06/02 2,50 0,93 4,95 19 8,0 (± 0,1) 2,8 (± 0,3) 14/10/02 1,20 1,90 2,43 16 38 (± 2,0) 5,5 (± 0,3) 13/01/03 2,08 0,93 4,96 17 9,0 (± 0,3) 5,1 (± 0,1) 28/04/03 1,50 1,02 4,53 19 27 (± 1,0) 4,5 (± 0,4) * não determinado Figura 10. Exemplo de perfil da irradiação solar. Porcentagens de incidência em relação à superfície são indicadas abaixo dos pontos de leitura. 0 400 800 1200 1600 5 4 3 2 1 0 coleta 28/04/2003 1% 10% 25% 50% 75% 100% Pr of un di da de (m ) Irradiância (µmol m-2 s-1) 51 Potenciais de óxido-redução diminuíram abruptamente em profundidades próximas ao sedimento, com exceção das coletas da primavera de 2002 e verão de 2003, que tiveram diminuição do potencial redox mais gradual e por toda a coluna d’água. No período das coletas valores máximos e mínimos foram próximos de 250 mV (inverno de 2002) e – 220 mV (verão de 2002), respectivamente, e entre máximos e mínimos de uma mesma coleta a diferença foi de 30 (verão de 2003) até 300 mV (outono de 2001). A condutividade teve padrões distintos, com aumento (e.g. outono de 2001), diminuição (e.g. perfis de primavera), pouca variação (primavera de 2001, verão de 2002) ou perfis com valores estáveis (e.g. inverno de 2002) em função da profundidade. As variações ocorreram em maior grau perto do sedimento, com exceção dos perfis de verão e outono de 2003, com decréscimo da condutividade desde a superfície. Valores mínimos e máximos no período foram de 0 a 90 mS/m, e ocorreram na coleta de verão de 2003. A turbidez oscilou entre – 10 e 300 NTU e os perfis foram em geral heterogêneos em relação a variações dos valores na coluna d’água, que aumentaram ou diminuiram, em segmentos perto do sedimento (e.g. inverno de 2002), da superfície (e.g. outono de 2001) ou mesmo oscilações entre aumento e decréscimo com a profundidade (e.g. primavera de 2002). Totais de sólidos dissolvidos (TDS) variaram entre 0,06 e 0,28 g L-1. Os valores deste parâmetro tiveram nenhuma ou pouca variação na coluna d’água, em geral perto do sedimento ou em oscilações mais próximas à superfície (verão de 2003) e na região central da coluna d’água (primavera de 2002). Concentrações do íon NH4 + aumentaram com a profundidade, e principalmente perto do sedimento, com exceção das oscilações dos valores na coluna d’água na primavera de 2002. As concentrações de NO3 - aumentaram com aumento da profundidade e por toda a coluna d’água, com exceção da queda de concentrações próxima ao sedimento no inverno de 2001 e das variações na coluna d’água na primavera de 2002. Os perfis de Ca2+ apresentaram vários padrões, com valores mais elevados próximos à superfície seguidos de decréscimo com a profundidade (outono de 2001), decréscimo na coluna d’água (coletas de inverno) às vezes seguido de aumento com a proximidade do sedimento (primavera de 2001 e verão de 2002), como também valores estáveis com a profundidade (verão de 2003) e aumento perto do sedimento (primavera de 2002). 52 A profundidade total do reservatório (Zmax) no ponto de coleta variou entre 16 (outubro de 2002, época de seca) e 20 m (março de 2001, época de chuvas). Dados de transparência da água pelo disco de Secchi estiveram correlacionados às extensões da zona eufótica (r = 0,86) e aos coeficientes de extinção vertical da luz (r = - 0,77). Profundidades mínimas da Zeu ocorreram na primavera (2,41 e 2,43 m) e máximas no inverno de 2002 e verão de 2003 (4,95 e 4,96 m). A ZDS teve uma correlação de - 0,62 com a turbidez, e a menor transparência da água (0,70 m) ocorreu quando a turbidez atingiu valores mais elevados, por volta de 300 NTU na coluna fótica (inverno de 2001). O coeficinte de extinção vertical da luz (kd) teve maior correlação com as concentrações de clorofila-a (r = 0,93) do que com total de sólidos dissolvidos (r = 0,87) e turbidez (r = 0,56). Os valores mais elevados de clorofila-a foram observados nas coletas de primavera e os menores valores no inverno de 2002 e verão de 2003. O carbono orgânico dissolvido variou de 2,7 a 7,1 mg L-1, sem uma tendência de variação das concentrações com as estações do ano. O perfil de irradiação da luz solar (Figura 10), exemplificado para a coleta de outono de 2003, teve aproximadamente 90 % da irradiação atenuada nos primeiros 2 m, e os 10 % restantes atenuados em menor intensidade até o limite da zona eufótica (4,53 m). 4.1.2) Composição monossacarídica de amostras da água do reservatório Monossacarídeos livres não foram detectados em todas as coletas realizadas. Os monossacarídeos glicose, galactose, manose e xilose estiveram presentes em todas as coletas, enquanto fucose, arabinose, ramnose, frutose e ribose não foram detectados com a mesma freqüência (Tabela 9). Todos os picos presentes nos cromatogramas foram identificados com padrões, exceto contaminações devido ao tratamento de dessalinização em resinas catiônicas e aniônicas (presentes também em branco com água destilada). A concentração total dos monossacarídeos variou de 0,21 mg L-1 (janeiro de 2002) a 0,9 mg L-1 (janeiro de 2003). A composição relativa entre os mesmos monossacarídeos em coletas distintas variou. Proporções mais elevadas foram de ramnose no outono e primavera de 2001, de frutose no inverno de 2001, de ramnose, manose e xilose no verão de 2002 e de glicose no restante das coletas. 53 Tabela 9. Composição e quantificação dos monossacarídeos totais dissolvidos da água do reservatório, nas coletas sazonais. Concentração em mg L-1 e porcentagem em relação à concentração total quantificada. Monossacarídeos 20/03/2001 09/07/2001 17/10/2001 21/01/2002 Fucose - - 0,05 (8,5 %) 0,01 (4,8 %) Ramnose 0,06 (27,3 %) 0,03 (6,3 %) 0,15 (25,4 %) 0,05 (23,8 %) Arabinose 0,05 (22,7 %) 0,05 (10,4 %) 0,07 (11,9 %) 0,04 (19,0 %) Galactose 0,03 (13,6 %) 0,04 (8,3 %) 0,12 (20,3 %) 0,03 (14,3 %) Glicose 0,03 (13,6 %) 0,12 (25,0 %) 0,13 (22,0 %) 0,03 (14,3 %) Manose/Xilose 0,05 (22,7 %) 0,06 (12,5 %) 0,07 (11,9 %) 0,05 (23,8 %) Frutose - 0,17 (35,4 %) - - Ribose - 0,01 (2,1 %) - - Total, mg L-1 0,22 0,48 0,59 0,21 Monossacarídeos 25/06/2002 14/10/2002 13/01/2003 28/04/2003 Fucose 0,02 (6,5 %) 0,03 (7,5 %) 0,06 (6,7 %) 0,01 (2,9 %) Ramnose - 0,05 (12,5 %) 0,15 (16,7 %) 0,05 (14,3 %) Arabinose - 0,04 (10,0 %) 0,05 (5,6 %) 0,04 (11,4 %) Galactose 0,09 (29,0 %) 0,08 (20,0 %) 0,21 (23,3 %) 0,05 (14,3 %) Glicose 0,15 (48,4 %) 0,12 (30,0 %) 0,26 (28,9 %) 0,11 (31,4 %) Manose/Xilose 0,05 (16,1 %) 0,08 (20,0 %) 0,17 (18,9 %) 0,09 (25,7 %) Frutose - - - - Ribose - - - - Total, mg L-1 0,31 0,40 0,90 0,35 - não detectado 54 4.1.3) Metais na água do reservatório: especiação e complexação de Cu e Cd As concentrações dos íons Cu2+ e Cd2+, associados à matéria orgânica e totais das coletas sazonais são sumarizadas na Tabela 10. Exemplos de polarogramas obtidos em análises por DPASV são apresentados na Figura 11. No período das coletas sazonais, as determinações de Cu tiveram mínimos e máximos de 4,3 x 10-8 M e 1,4 x 10-7 M para Cutot, 3,9 x 10-8 M e 2,1 x 10-7 M para CuMO e 3,0 x 10-10 M e 1,1 x 10-9 M para Cu2+. Nas coletas, as concentrações iônicas variaram de 0,3 a 1,2 % do total de Cu e as concentrações de CuMO foram semelhantes às de Cutot em comparações por teste t de Student, exceto em junho de 2002. Portanto, esta é a indicação de que a maioria do Cu estava associado à MOD. Nas coletas em que o Cutot foi inferior ao CuMO e principalmente em junho de 2002 que teve esta comparação estatisticamente distinta, é presumido que pelo fato da maioria do Cu estar associado à MOD, o procedimento de fervura com HNO3 para determinação do Cutot tenha sido menos eficiente, quer seja na perda ou na extração de Cu, em relação ao procedimento de digestão da MOD por UV e determinação do CuMO. A menor porcentagem de associação do Cu à MOD foi de 78 % em março de 2001, enquanto nas outras coletas observou-se associação de quase todo o Cu dissolvido com a MOD. Ao contrário do Cu, não houve associação de Cd com a MOD, com base nas determinações de Cd2+ que foram estatisticamente semelhantes (teste t de Student) aos valores obtidos após tratamento em reator de fotodegradação da MOD. Nas coletas de junho e outubro de 2002 o CdMO foi inferior ao Cd2+. Este resultado pode ser decorrente de falhas na digestão da MOD das amostras. As determinações de Cdtot apresentaram erros da média altos nas três primeiras coletas, e não houve detecção do pico de Cd em DPASV nas coletas restantes. A não-detecção ou variação nas concentrações de Cdtot das amostras após o tratamento ácido e com fervura pode ter sido consequência da volatilização do Cd em altas temperaturas, junto com outras substâncias presentes na água, como por exemplo cloretos (Prichard, 1996). Portanto, este procedimento de digestão foi considerado inadequado para determinações de Cdtot nos casos apresentados. Contudo, nas coletas em que o Cdtot foi quantificado, suas concentrações foram estatisticamente semelhantes (teste t de Student) às de Cd2+, sugerindo que a maioria do Cd estava livre na água do reservatório. As concentrações de Cd2+ variaram entre 4,8 x 10-8 M e 2,1 x 10-6 M, evidenciando uma tendência de aumento progressivo desta espécie ao longo do tempo (Tabela 10). 55 Tabela 10. Concentrações totais de Cu e Cd e das espécies iônicas e associadas à matéria orgânica. Média e ± erro da média (n = 3). Coleta Cutot (M) CuMO (M) Cu2+ (M) 20/03/2001 1,1 (± 0,2) x 10-7 8,6 (± 0,6) x 10-8 3,0 (± 0,5) x 10-10 09/07/2001 4,3 (± 0,7) x 10-8 3,9 (± 0,7) x 10-8 3,7 (± 0,1) x 10-10 17/10/2001 1,1 (± 0,2) x 10-7 1,5 (± 0,3) x 10-7 1,1 (± 0,2) x 10-9 21/01/2002 1,0 (± 0,3) x 10-7 1,2 (± 0,3) x 10-7 1,1 (± 0,1) x 10-9 25/06/2002 1,4 (± 0,1) x 10-7* 2,1 (± 0,1) x 10-7 6,0 (± 1,3) x 10-10 14/10/2002 8,2 (± 0,3) x 10-8 1,9 (± 0,4) x 10-7 4,0 (± 0,5) x 10-10 13/01/2003 1,0 (± 0,1) x 10-7 1,4 (± 0,4) x 10-7 5,5 (± 1,1) x 10-10 28/04/2003 7,3 (± 1,4) x 10-8 8,9 (± 1) x 10-8 8,7 (± 1,1) x 10-10 Coleta Cdtot (M) CdMO (M) Cd2+ (M) 20/03/2001 3,9 (± 2,1) x 10-8 - 4,8 (± 0,8) x 10-8 09/07/2001 7,5 (± 5,1) x 10-8 * 1,4 (± 0,4) x 10-7 1,3 (± 0,1) x 10-7 17/10/2001 1,3 (± 1) x 10-7 1,3 (± 0,2) x 10-7 1,1 (± 0,1) x 10-7 21/01/2002 _* 1,2 (± 0,2) x 10-7 1,6 (± 0,1) x 10-7 25/06/2002 _* 1,3 (± 0,1) x 10-7 2,1 (± 0,1) x 10-7 14/10/2002 _* 1,5 (± 0,2) x 10-7 4,3 (± 0,3) x 10-7 13/01/2003 _* 1,5 (± 0,2) x 10-7 1,4 (± 0,1) x 10-6 28/04/2003 _* 3,3 (± 0,9) x 10-8 2,1 (± 0,1) x 10-6 * Problemas na metodologia - não detectado 56 Figura 11. Exemplos de polarogramas obtidos nas determinações de Cu e Cd, através de DPASV. 57 O esquema de especiação proposto para as coletas sazonais foi simplificado, excluindo-se as espécies Mláb e MI, pelos motivos apresentados a seguir. Os complexos lábeis não foram quantificados diretamente através de DPASV. É suposto que, além da presença de baixas concentrações lábeis, a matéria orgânica inerente de ambientes eutróficos, como o reservatório de Barra Bonita, impossibilitou a detecção devido à interferência no eletrodo de mercúrio (Neubecker & Allen, 1983). A estimativa indireta de MI não foi feita, devido às concentrações de Mtot terem sido semelhantes ou inferiores às concentrações de MMO no caso do Cu, e Cdtot não ter sido analisado na maioria das coletas pelos problemas de metodologia descritos acima. Na Tabela 11 são mostrados os resultados das determinações de Culáb, Cutot dissolvido, Cutot recuperável, Cu particulado recuperável e Cu particulado recuperável por g de TDS realizadas no laboratório de Química Ambiental da UFPR. A concentração de Cutot dissolvido (1,6 x 10-7 M) foi próxima à maioria dos valores de Cutot e CuMO das coletas sazonais, assim como da média das 8 análises de Cutot e CuMO, 1,1 x 10–7 M e 1,3 x 10-7 M, respectivamente. O Culáb foi equivalente a 24,4 % do Cutot dissolvido. A concentração de Cutot recuperável foi representada por 69,6 % de Cutot dissolvido e 30,4 % de Cu particulado recuperável. Com a medida de TDS desta coleta (0,11 g L-1), foi obtida a concentração de 6,4 x 10-7 M de Cu recuperável por g de material particulado. As curvas de titulação (ISE) dos metais com a água do reservatório resultaram, em todas as coletas analisadas, na complexação de Cu e não-complexação de Cd, como exemplificado para a coleta de janeiro de 2003 (Figura 12). Análises gráficas com base no método de Scatchard para os dados da titulação de Cu foram ajustadas com duas retas de regressão linear, representando as classes 1 e 2 de ligantes, como exemplificado na Figura 13. Para cada classe de ligantes de Cu, a constante de estabilidade condicional (K’) e a concentração de ligantes (CL) foi calculada através dos coeficientes das regressões lineares dos pontos. Os parâmetros de complexação de Cu nas 8 coletas sazonais são resumidos na Tabela 12. Comparações do tipo teste t de Student entre os mesmos parâmetros das duas classes de ligantes (log K’1 x log K’2, CL1 x CL2) resultaram em diferenças significativas, demonstrando a distinção dos parâmetros entre estas duas classes com a metodologia utilizada. A classe 1, representada pela reta de regressão linear com maior inclinação (Figura 13), teve os ligantes com maior afinidade para o Cu, com K’1 entre 7,9 e 8,4 e CL1 entre 1,1 x 10-6 M e 1,4 x 10-6 M. A classe 2 teve ligantes mais fracos, com valores de K’2 entre 5,7 e 58 6,2 e CL2 entre 5,3 x 10-6 M e 7,7 x 10-6 M. Por outro lado, todas as comparações por ANOVA paramétrica entre os parâmetros correspondentes a uma mesma classe de ligantes para Cu mas em coletas distintas resultaram em semelhanças, indicando a complexação similar de Cu em todo o período estudado. Nestas 8 coletas, a média dos valores de K’1 foi mais elevada do que a média de K’2 por volta de 3 ordens de grandeza, enquanto a média de CL1 foi aproximadamente 5,5 vezes inferior à média de CL2. Tabela 11. Concentrações de cobre lábil, total dissolvido, total recuperável, da fração do total recuperável proveniente da fase particulada, e a concentração recuperável por g de total de sólidos dissolvidos. Espécies Concentração (M) Cutot recuperável 2,3 x 10-7 Cutot dissolvido 1,6 x 10-7 Culáb 3,9 x 10-8 Cu particulado recuperável 7,0 x 10-8 Cu particulado recuperável por g de TDS * 6,4 x 10-7 * TDS: total de sólidos dissolvidos; 0,11 g L-1 em março de 2003. Figura 12. Exemplos de curvas de titulação da água do reservatório com Cu ( ) e Cd ( ). Não complexação (---) : [metal total] = [M 2+]. Barras: erro da média (n = 3). -6,4 -6,2 -6,0 -5,8 -5,6 -5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -9,0 -8,5 -8,0 -7,5 -7,0 -6,5 -6,0 -5,5 -5,0 lo g M 2+ (M ) log M tot (M) 13/01/2003 59 Figura 13. Exemplo de análise gráfica pelo método de Scatchard para titulação da água do reservatório com Cu. ( --- ) Regressão linear para cálculo dos parâmetros de complexação das classes (1) e (2) de ligantes. Tabela 12. Complexação de Cu pela água filtrada de Barra Bonita. Parâmetros constante de estabilidade condicional (K’) e concentração de ligantes (CL), obtidos por ISE e capacidade de complexação aparente (ccap), obtida por DPASV. Média e ± erro da média (n = 3). Coleta Log K’1 CL1 (M) Log K’2 CL2 (M) ccap (M) 20/03/01 8,1 (±0,14) 1,1 (±0,1) x 10-6 6,2 (±0,02) 6,9 (±0,2) x 10-6 1,4 (±0,2) x 10-7 09/07/01 8,1 (±0,1) 1,4 (±0,1) x 10-6 5,7 (±0,03) 6,7 (±0,1) x 10-6 2,4 (±0,2) x 10-7 17/10/01 8,0 (±0,2) 1,3 (±0,1) x 10-6 5,9