UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS UFSCar/UNESP Ajustes cardiovasculares em modelo experimental descerebrado, cascavel sul americana (Crotalus durissus) Driele Tavares São Carlos 2021 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS UFSCar/UNESP Ajustes cardiovasculares em modelo experimental descerebrado, cascavel sul americana (Crotalus durissus) Driele Tavares Tese apresentada ao Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para obtenção do título de doutora em ciências fisiológicas. São Carlos 2021 IV “Ao meu passado Eu devo o meu saber e a minha ignorância As minhas necessidades, as minhas relações A minha cultura e o meu corpo Que espaço o meu passado deixa para a minha liberdade hoje? Não sou escrava dele” Amarelo, azul e branco (ANAVITÓRIA, Rita Lee) V Dedico: Aos meus pais: Regina e Roberto VI AGRADECIMENTOS À minha família, pelo apoio, suporte e compreensão pelos dias distantes. Ao meu orientador Dr. Cleo Alcantara Costa Leite, pelo suporte, grandes explicações e aulas com muita paciência, otimismo e amor pela ciência. Obrigada por me permitir embarcar nesse projeto. À minha orientadora Dra. Marisa Narciso Fernandes, pela confiança, apoio incondicional, incentivo e cuidado, serei eternamente grata! Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de São Carlos e ao Departamento de Ciências Fisiológicas da UFSCar. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (proc. 168061/2017-1) e à FAPESP (proc. 2018/05035-0), pelo apoio financeiro para realização deste trabalho. Ao Instituto Butantan pela parceria e fornecimento dos animais. Ao tecnólogo Gustavo Marega Oda, pelos cuidados com os animais, ensinamentos de manejo, equipamentos, softwares e apoio na realização das cirurgias. Aos demais funcionários do departamento sempre prestativos e solícitos, Sr. Ângelo, Carmem, Dona Graça, Dona Bete. Às alunas Samanta e Gabriella que iniciaram os trabalhos com a cascavel descerebrada e me ensinaram tudo com bastante paciência. Ao amigo e colega de profissão Lucas Zena, por toda troca de experiências e conhecimentos, apoio e risadas. Aos demais colegas do Laboratório de Biologia Experimental pela grande ajuda ao longo da jornada, sendo auxiliando as cirurgias, discutindo dados, montando setup, fazendo faxina ou churrasco. Aos amigos e colegas de laboratório (e programa): Lívia, Cibele, Samanta, Gustavo, Sofia, Pri Siqueira, Fabrício, Natália Viana, Natália Portruneli, Vicente, Mariana, Polly, Henrique, Carol, DW, Eliton, Nathan, Rocco, Noeli, Israel, Z, Michelly, Elisa, Mari, Renato VII e tantos outros que passaram pela minha vida nesses longos anos de pós. Todo meu carinho e gratidão! À “minha aluna” Sofia, por acreditar e confiar em mim e sempre me incentivar. Espero que essa parceria se repita um dia. Seu entusiasmo pela ciência me inspira! Um agradecimento especial à colega de laboratório e grande amiga, Lívia, por toda ajuda no lab, muita coisa não seria tão fácil sem seu apoio e espírito de equipe. Agradeço também aos momentos de risadas e choros ao longo dos anos dividindo o Apartamento 12. À parceria para atravessar a pandemia com o mínimo de sanidade mental. Aos bólos e lanchos e vinhos e pacaemba e máscaras e álcool em gel! Ao amigo Gu, mais do que um tecnólogo, um ombro amigo pra todas as horas, uma enciclopédia ambulante, um apoio fundamental. Sou imensamente grata por todos os momentos ao lado de umas das pessoas mais generosas que eu conheci. Um biólogo excepcional. Exemplo de profissional. Espero, um dia, poder trabalhar novamente ao seu lado! Valeuuuuu Guuuuuuu! Às minhas amigas de Baurucity: Tati, Gih e Dessa, todo meu amor e gratidão pela distração de tudo relacionado ao trabalho! Rs A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho, meu muito obrigada! “A grandeza de um homem não está na quantidade de riqueza que ele adquire, mas em sua integridade e habilidade de afetar positivamente as pessoas ao redor.” Bob Marley VIII RESUMO A classe dos répteis ocupa posição importante dentre os vertebrados para investigações acerca da evolução dos mecanismos modulatórios no sistema cardiovascular. Alguns estudos cardiovasculares são desenvolvidos com medições in situ, em modelos experimentais sob anestesia terminal. Infelizmente, esta abordagem compromete as respostas cardiovasculares por suprimir as modulações autonômicas. O presente trabalho avalia a efetividade de um novo modelo experimental para estudos cardiovasculares em Squamatos, utilizando animais descerebrados. O modelo permite o registro de diversas variáveis fisiológicas em uma preparação de animal eutanasiada com o sistema nervoso autonômico (SNA) funcional, livres de interferentes anestésicos. Para que a preparação descerebrada seja considerada efetiva, são necessários diversos níveis de validações que observam: a capacidade de recuperação do SNA; a integridade desse sistema na situação experimental; sua capacidade de processar e coordenar respostas perante desafios; seu grau de similaridade com o animal intacto; assim como o tempo de viabilidade funcional da preparação. Assim, trabalhamos com os seguintes objetivos: (1) avaliar o perfil da progressão de recuperação pós-cirúrgica dos valores médios dos parâmetros cardiovasculares em repouso e sua estabilidade ao longo do tempo; (2) avaliar o nível de recuperação pós-cirúrgica da modulação autonômica de um mecanismo cardiovascular complexo, como o barorreflexo; (3) avaliar o perfil da progressão de recuperação pós-cirúrgica autonômica, refletido por índices modulatórios, como Variabilidade da Frequência Cardíaca (VFC) e barorreflexo; (4) avaliar a capacidade de resposta e adaptação do SNA na regulação hemodinâmica das preparações submetidas à desafios hemodinâmicos. Observamos que as preparações foram capazes de manter parâmetros cardiovasculares médios em repouso, estáveis e em nível similar aos de animais intactos. Com a preparação, foi possível realizar instrumentação de alta complexidade, registrar um grande número de parâmetros concomitantes e integrá-los. Os índices barorreflexos, representativos de processos modulatórios autonômicos complexos, foram recuperados ao nível observado por animais intactos em repouso, 3 dias após a cirurgia. Os indicadores modulatórios autonômicos utilizados (barorreflexo e VFC) perduram estáveis por pelo menos 15 dias. As preparações foram capazes de realizar ajustes hemodinâmicos complexos em resposta a desafios hemodinâmicos e estímulos de quimiorreceptores após longo período depois do procedimento cirúrgico. A aplicação de anestesia altera o perfil de respostas modulatórias aos desafios nas mesmas condições, comprovando a persistência dos processos autonômicos. Concluímos que o modelo é representativo, por ser capaz de manter parâmetros cardiovasculares estáveis e similares a animais intactos; é útil, por ser capaz de prover registro de múltiplas variáveis, de recuperar modulações autonômicas em nível similar ao de animais intactos; e viável para procedimentos de longo prazo, por manter tais capacidades por longo tempo após a eutanásia. Palavras-chave: cascavel, descerebração, sistema nervoso autônomo, barorreflexo, variabilidade da frequência cardíaca, cardiovascular, anestesia. IX ABSTRACT The reptile class has considerable importance among vertebrates for investigations about the evolution of modulatory mechanisms in the cardiovascular system. Some cardiovascular studies have been performed with in situ measurements and experimental models under terminal anesthesia. Unfortunately, this approach compromises cardiovascular responses by suppressing autonomic modulations. The present study analyzes the effectiveness of a new experimental model for cardiovascular studies in Squamates using decerebrate animals. The model allows recording several physiological variables on an animal preparation euthanized with a functional autonomic nervous system (ANS), free of anesthetic interferences. For the decerebrate preparation to be considered adequate, several levels of validations are needed that observe: the ANS's ability to recover; the integrity of that system throughout the experimental process; its ability to process and coordinate responses to challenges; its degree of similarity with the intact animal, as well as the functional viability time of the preparation. Thus, we had the following objectives: (1) to evaluate the profile of the progression of post- surgical recovery on the mean values of cardiovascular parameters at rest and its stability over time; (2) to assess the post-surgical recovery level of the autonomic modulation of a complex cardiovascular mechanism, such as the baroreflex; (3) to assess the profile of the progression of autonomic post-surgical recovery, reflected by modulatory indices, such as Heart Rate Variability (HRV) and baroreflex; (4) to evaluate the ANS's responsiveness and adaptation of the hemodynamic regulation of preparations submitted to hemodynamic challenges. We observed that the preparations maintained mean cardiovascular parameters at rest stable and similar to those of intact animals. Furthermore, with the preparation, it was possible to accomplish highly complex instrumentation, record a large number of concomitant parameters and integrate them. Baroreflex indices, representative of complex autonomic modulatory processes, were recovered to the level observed on intact animals at rest three days after surgery. The autonomic modulatory indicators used (baroreflex and HRV) remained stable for at least 15 days. The preparations were able to perform complex hemodynamic adjustments in response to hemodynamic challenges and chemoreceptor stimuli for an extended period after the surgical procedure. The anesthesia procedure changed the profile of modulatory responses to challenges under the same conditions, proving the persistence of autonomic processes. We conclude that the model is representative of the species, as it can maintain the cardiovascular parameters similar to those of intact animals. It is a valuable model because it allows for multiple variables recording. It is viable for long-term procedures, as it maintains these capabilities for a long time after euthanasia. Keywords: rattlesnake, decerebration, autonomic nervous system, baroreflex, heart rate variability, cardiovascular, anesthesia. X LISTA DE AREVIATURAS ANS - sistema nervoso autônomo BEI - índice de eficiência barorreflexa BRS – sensibilidade barorreflexa C - complacência vascular CO - débito cardíaco ECG - eletrocardiograma EPM – erro padrão da média Fe – fenilefrina ƒH - freqüência cardíaca G50 – ganho barorreflexo Gop – ganho operacional barorreflexo Gpul: condutância pulmonar Gsys: condutância sistêmica IP – intervalo de pulso NaCN – cianeto de sódio ?̇?Lao - fluxo do arco sistêmico esquerdo PAMpul - pressão arterial média pulmonar PAMsys - pressão arterial média sistêmica PCO2 - pressão parcial de dióxido de carbono PSD - densidade espectral de potência ?̇?pul - fluxo sanguíneo pulmonar ?̇?sis - fluxo sanguíneo sistêmico XI RMSSD - Raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre intervalos NN adjacentes RRi - intervalo R-R entre batidas SDNN - Desvio Padrão de todos os intervalos NN SNP – nitroprussiato de sódio VFC - variabilidade da frequência cardíaca Vstot - volume sistólico total XII LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO GERAL Figura 1. Esquema representativo do coração de répteis não crocodilianos. (Driele Tavares)................................................................................................................................21 Figura 2. Esquema simplificado da circulação de répteis não crocodilianos. (Driele Tavares) ..............................................................................................................................................22 Figura 3. Esquema simplificado do desvio intracardíaco (DIc). (Driele Tavares) .............23 Figura 4. Exemplar de Cascavel Sul Americana, Crotalus durissus. (Foto: Gustavo Marega Oda) .....................................................................................................................................34 CAPÍTULO 1 Figura 1. Parâmetros cardiovasculares e barorreflexos ao longo do tempo após cirurgia em cascavéis intactas, Crotalus durissus. Os valores foram obtidos pelo Método da Sequência de análise barorreflexa. (a) frequência cardíaca - ƒH; (b) pressão arterial média - PAM; (c) ganho barorreflexo operacional - Gop; (d) índice de eficiência barorreflexa - BEI. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam diferença estatística (One-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 8)...........................................................................................52 Figura 2. Parâmetros cardiovasculares e barorreflexos ao longo do tempo após cirurgia em cascavéis descerebradas, Crotalus durissus. Os valores foram obtidos pelo Método da Sequência de análise barorreflexa. (a) frequência cardíaca - ƒH; (b) pressão arterial média - PAM; (c) ganho barorreflexo operacional - Gop; (d) índice de eficiência barorreflexa - BEI. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam diferença estatística (One-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 8)...........................................................................................53 Figura 3. Valores do barorreflexo entre os grupos experimentais, cascavéis não descerebradas e preparações descerebradas após a recuperação. A - Valores médios de ganho barorreflexo operacional (Gop) e ganho barorreflexo máximo (G50), 72h após a cirurgia: coluna preta - cascavéis não descerebradas; coluna cinza - preparações descerebradas. B - Curvas barorreflexas sigmoides médias obtidas com o método farmacológico: linha preta - cascavéis não descerebradas; linha cinza - preparações XIII descerebradas. Setas pontilhadas indicam Gop. Setas contínuas indicam G50. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam valores diferentes. (Two-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 6)..........................................................................................................................54 CAPÍTULO 2 Figura 1. Passos do processo de descerebração em cascavel sul-americana Crotalus durissus. Sequências de imagens do dorso da cabeça de cascavel (682,54g) através de campo cirúrgico, onde observa-se: A, indicação da área de incisão (seta vermelha); B, incisão rostro-caudal medial; C, abertura do crânio com visão do vaso central; D, visão do teto óptico após cauterização do vaso e abertura das meninges; E, cavidade remanescente após cauterização e retirada do tecido nervoso; F, cavidade preenchida para estabilização. Escala 5mm......................................................................................................................................75 Figura 2. Imagens de encéfalo de cascavel não descerebrada, Crotalus durissus (898,75 ± 264,75g). A - Imagem da superfície do SNC, vista dorsal; B - imagem da superfície do SNC, vista lateral; C - histologia do SNC, secção coronal na região medial; D - histologia do SNC, secção sagital na região medial. Linha tracejada indica área de corte no processo de descerebração. Ce - cerebelo, Hc- hemisférios cerebrais, Bu - bulbo, Bo - bulbos olfatórios, Qo - quiasma óptico, To - teto óptico, Po - ponte, Me - medula espinhal. Coloração Tricrômio de Masson............................................................................................................76 Figura 3. Imagens de encéfalo de cascavel descerebrada, Crotalus durissus (682,54). - Imagem da superfície do SNC, vista dorsal; A - imagem da superfície do SNC; B - imagem da superfície do SNC, vista lateral; C - histologia do SNC, secção coronal na região medial; D - histologia do SNC, secção sagital na região medial. Seta vermelha indica uma área da seção para descerebração. Ce - cerebelo, Bu - bulbo, To - teto óptico, Po - ponte, Me - medula espinhal. Coloração Tricrômio de Masson...........................................................................77 Figura 4. Variação da frequência cardíaca média (ƒH - Painel A) e densidade espectral (PSD - Painel B) ao longo do tempo, após procedimento de descerebração em cascavéis, Crotalus durissus, a 30°C. Círculos são valores médios ± EPM. O tempo zero é a primeira hora após a cirurgia. Letras diferentes indicam medias diferentes (Kruskal-Wallis - Dunns’s, P <0,05, n = 10)...................................................................................................................................78 XIV CAPÍTULO 3 Figura 1. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Head Lift. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8).......................................................................................................................105 Figura 2. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Head Lift. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul·?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8)....................................................................................................................................106 Figura 3. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Tail Lift. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8).......................................................................................................................108 Figura 4. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Tail Lift. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul·?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada XV sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8)....................................................................................................................................109 Figura 5. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano perante desafio de quimiorrecepção ao NaCN. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8)...........................................................111 Figura 6. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano perante desafio de quimiorrecepção ao NaCN. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul· ?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8).............................................................................................112 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 Tabela 1. Valores médios dos parâmetros cardiovasculares e do barorreflexo no estabelecimento da recuperação e ao final do protocolo experimental. Os valores foram obtidos com o Método da Sequência de análise barorreflexa................................................54 CAPÍTULO 2 Tabela 1. Parâmetros de VFC ao longo do tempo após descerebração em cascavel, C. durissus, a 30°C ...................................................................................................................78 XVI Tabela 2. Parâmetros cardiovasculares de preparações de cascavel (Crotalus durissus), descerebradas estáveis, a 25°C, com e sem anestesia inalatória (2% de isoflurano) e 24h após descerebração.......................................................................................................................79 Tabela 3. Barorreflexo em grupos experimentais de cascavéis descerebradas, Crotalus durissus: preparação estável e preparação anestesiada (2% de isoflurano).........................80 Tabela 4. Parâmetros cardiovasculares de estudos prévios em cascavel (Crotalus durissus), com e sem anestesia ............................................................................................................82 XVII SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................................................... 20 1.1 Coração e circulação dos répteis ................................................................................. 20 1.2 Controle cardiovascular pelo SNA e mecanismos regulatórios .............................. 23 1.3 Encéfalo reptiliano......................................................................................................... 28 1.4 Estresse animal, dor e interferentes cirúrgicos .......................................................... 29 1.5 Descerebração ................................................................................................................ 32 1.6 Cascavel .......................................................................................................................... 33 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 35 2.1 Objetivo geral ................................................................................................................. 35 2.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 35 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 36 CAPÍTULO 1 - A modulação autonômica do modelo de cascavel descerebrada (Crotalus durissus) é similar à do animal não-descerebrado 1. Introdução ............................................................................................................................... 46 2. Material e métodos ................................................................................................................ 47 2.1 Animais experimentais.................................................................................................. 47 2.2 Preparação animal e descerebração ............................................................................. 47 2.3 Instrumentação para o barorreflexo............................................................................. 48 2.4 Registros e protocolo experimental ............................................................................. 49 2.5 Análises barorreflexas ................................................................................................... 49 2.6 Análise estatística .......................................................................................................... 50 3. Resultados ............................................................................................................................... 51 XVIII 3.1 Barorreflexo ao longo do tempo .................................................................................. 51 3.2 Cascavel não descerebrada x preparação descerebrada após estabilização ........... 53 4. Discussão ................................................................................................................................ 55 5. Considerações Finais ............................................................................................................. 59 6. Referências ............................................................................................................................. 60 CAPÍTULO 2 - Recuperação e persistência da monulação autonômica em cascavéis descerebradas (Cortalus durissus) 1. Introdução ............................................................................................................................... 66 2. Matérial e métodos ................................................................................................................ 68 2.1 Animais experimentais.................................................................................................. 68 2.2 Descerebração e registro de ECG ................................................................................ 68 2.3 Anatomia e histologia ................................................................................................... 70 2.4 Variáveis cardiovasculares ........................................................................................... 70 2.5 Protocolo experimental e análise de dados ................................................................ 71 2.6 Análise estatística .......................................................................................................... 73 3. Resultados ............................................................................................................................... 74 3.1 Anatomia e histologia ................................................................................................... 74 3.2 Modulação autonômica após descerebração .............................................................. 77 3.3 Parâmetros cardiovasculares em repouso em animais descerebrados .................... 78 3.4 Modulação cardiovascular autonômica oferece suporte ao barorreflexo ............... 80 3.5 O efeito da anestesia sobre os parâmetros cardiovasculares .................................... 80 4. Discussão ................................................................................................................................ 83 5. Considerações finais .............................................................................................................. 90 6. Referências ............................................................................................................................. 90 XIX CAPÍTULO 3 - Modulação cardiovascular em cascavéis (Crotalus durissus) descerebradas: viabilidade da preparação para protocolos longos 1. Introdução ............................................................................................................................... 99 2. Materiais e métodos ............................................................................................................ 100 2.1 Animais experimentais................................................................................................ 100 2.2 Cirurgias de descerebração e instrumentação .......................................................... 100 2.3 Protocolo experimental ............................................................................................... 102 2.4 Análise de dados e estatística ..................................................................................... 103 3. Resultados ............................................................................................................................. 104 3.1 Redução da perfusão cefálica ..................................................................................... 104 3.2 Aumento de retorno venoso ....................................................................................... 107 3.3 Estímulos de quimiorreceptores ................................................................................ 110 4. Discussão .............................................................................................................................. 113 5. Considerações finais ............................................................................................................ 117 6. Referências ........................................................................................................................... 117 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 123 20 1. INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Coração e circulação dos répteis O coração dos répteis tem despertado interesse por décadas. Isto acontece não só pela sua morfologia complexa, mas também pela capacidade de desviar frações de fluxo sanguíneo entre os dois circuitos, sistêmico ou pulmonar, a cada ciclo. Tal desvio sanguíneo intracardíaco daria suporte a uma série de ajustes fisiológicos importantes para a homeostasia (Hicks, 2002). Este é um assunto que se mantém sob intenso debate ao longo dos anos. Estruturalmente o coração dos squamatos é constituído por um seio venoso contrátil em grande parte das espécies; dois átrios, um esquerdo (AE) e um direito (AD), separados completamente por um septo, além de um ventrículo. O ventrículo único é uma estrutura complexa, subdividida em três câmaras interconectadas denominadas cavum pulmonale (CP), cavum venosum (CV) e cavum arteriosum (CA). Uma estrutura denominada crista muscular separa o CP das demais câmaras e sua borda dorsolateral não oclui a luz do ventrículo, permitindo comunicação entre as câmaras. Assim, é possível que volume de sangue arterial ou venoso sejam bombeados de volta ao circuito de onde vieram, caracterizando um desvio sanguíneo intracardíaco (Hicks e Comeau, 1994). Três grandes vasos originam-se do ventrículo, a artéria pulmonar (AP), arco sistêmico direito (AoD) e arco sistêmico esquerdo (AoE). A artéria pulmonar surge a partir do CP e as aortas do CV. Assim que emerge do coração o AoD se divide em subclávias e artérias carótidas e um terceiro ramo do AoD (braquiocefálico) se une ao AoE para formar a aorta dorsal (Hicks, 1994). 21 Figura 1. Esquema representativo do coração de répteis não crocodilianos. (Driele Tavares). Na circulação desses animais, o sangue arterial oxigenado chega ao AE pelas veias pulmonares. O sangue venoso sistêmico, desoxigenado, chega através das veias cavas ao coração pelo seio venoso que se abre no AD. Durante a diástole ventricular, o sangue venoso vindo do AD é preferencialmente direcionado ao CP passando pela crista muscular que o separa do CV. Nesta fase, o sangue rico em oxigênio entra preferencialmente no CA vindo do AE. Durante a sístole ventricular, o sangue é ejetado nas artérias sistêmicas proveniente do CA passando pelo CV. O sangue venoso é preferencialmente bombeado para o pulmão pela artéria pulmonar, vindo do CP. No momento inicial da sístole, a contração do músculo cardíaco faz com que a crista muscular feche essa comunicação entre CV e CP, causando separação entre o circuito sistêmico e o pulmonar até o próximo ciclo (Wang et al., 1997; Jensen, et al., 2010). 22 Figura 2. Esquema simplificado da circulação de répteis não crocodilianos. (Driele Tavares) Os desvios sanguíneos são definidos de acordo com sua direção, como sendo da direita para a esquerda (D-E) ou da esquerda para a direita (E-D). O desvio D-E representa recirculação de sangue sistêmico (pobre em oxigênio) de volta a circulação arterial sistêmica. Uma vez que este volume de sangue não passa pelos pulmões, a porção desviada não tem chance de ser reoxigenada. Em contraste, o desvio E-D representa a recirculação do sangue pulmonar (rico em oxigênio) para a circulação pulmonar com efeito oposto sobre a PO2 arterial sistêmica. Os desvios podem ocorrer simultaneamente a cada ciclo cardíaco, por mecanismos de pressão ou de lavagem de forma que é possível ambos desvios em um mesmo ciclo cardíaco (Hicks, 2002; Hicks e Wang, 1996, 2012). Direção e magnitude do desvio podem ser afetadas pela modulação autonômica da resistência periférica dos circuitos sistêmico e pulmonar, e pela atividade vagal na regulação colinérgica na resistência arterial central, no circuito pulmonar (Hicks, 1994). A relação entre as resistências periféricas dos circuitos sistêmico e pulmonar e, principalmente, a constrição da artéria pulmonar, definem o quanto de sangue recirculará em cada circuito. Uma resistência pulmonar baixa favorece o desvio sanguíneo E-D. Alta resistência pulmonar favorece o desvio sanguíneo D-E (Eme et al., 2009, 2010; Leite et al., 2013, 2014; Burggren et al, 2020). 23 Figura 3. Esquema simplificado do desvio intracardíaco (DIc). (Driele Tavares). 1.2 Controle cardiovascular pelo SNA e mecanismos regulatórios O Sistema Nervoso Autônomo (SNA) é o grande responsável pela modulação das funções fisiológicas não-voluntárias que dão suporte à vida. O coração dos répteis é inervado por ramos nervosos adrenérgicos excitatórios do SNA-simpático e pelos ramos inibitórios colinérgicos do SNA-parassimpáticos. Esta inervação alcança os átrios, incluindo a região do marca-passo, e o ventrículo (Wang et al., 2001a,b). A função parassimpática é exercida principalmente pelo nervo vago, que desempenha um papel importante na função autonômica em répteis inervando coração, traqueia, pulmões, vasculatura pulmonar e coronariana, dentre outros (Taylor et al., 1999). Em seu ramo aferente, o vago leva informações dos quimiorreceptores de O2 presentes no arco aórtico e dos receptores de CO2 dentro do pulmão, dentre diversas outras. O ramo eferente inclui inervação do coração, músculo liso pulmonar e o esfíncter ao redor da artéria pulmonar (Altimiras et al., 1997; Wang et al., 2001a,b). 24 O desempenho cardíaco sofre grande efeito de dois parâmetros funcionais: a frequência cardíaca e o volume sistólico. Estes são controlados por fatores neurais com a inervação do marca-passo e músculo cardíaco e fatores não neurais, como a distensão tecidual causada pelo enchimento cardíaco (mecanismo de Frank-Starling) ou substâncias circulantes (hormônios). Diversas substâncias possuem influência na modulação do trabalho cardíaco. O efeito da modulação adrenérgica no coração e de outras partes do sistema circulatório (ex.: via catecolaminas, tais como epinefrina e norepinefrina) também parece ser uma característica filogeneticamente antiga. A influência das catecolaminas circulantes liberadas por células cromafins distribuídas difusamente desempenham um papel significativo nos vertebrados. O tecido cromafín é comum em ciclóstomos e está intimamente associado aos gânglios simpáticos organizados por segmentos em elasmobrânquios e, em grande parte, em teleósteos e anfíbios (Laurent et al., 1983). Estudos em cascavéis demonstraram que a estimulação adrenérgica leva à efeitos sistêmicos, como vasoconstrição e diminuição na condutância vascular. Isto redireciona o sangue para o circuito pulmonar. Um efeito menos pronunciado desta modulação foi visto na vasculatura pulmonar, sugerindo que a determinação do desvio se deve primariamente ao controle adrenérgico na condutância sistêmica (Galli et al., 2007). Resultados semelhantes foram observados por Overgaard e colaboradores (2002) em Trachemys scripta. O controle vagal colinérgico inibitório do coração (na qual o principal neurotransmissor é a acetilcolina) é uma característica de todos os vertebrados. Este estimulo parece desempenhar papel importante no controle do desvio cardíaco em répteis cuja vasculatura pulmonar possui uma inervação vasoconstrictora colinérgica (Wang et al., 2001; Skovgaard e Wang, 2006). Como foi observado por Hicks (1994) após estimulação parassimpática vagal em Pseudemys scripta, ocorreu um aumento do desvio D-E. Em cascavéis (in situ), Taylor e colaboradores (2009) observaram que a estimulação elétrica eferente do vago esquerdo provoca contração da artéria pulmonar. Análises histológicas comprovaram ampla inervação parassimpática ao longo da artéria pulmonar (Filogonio et al., 2020). Corroborando com esses achados, a vagotomia do ramo esquerdo em cascavéis foi responsável pelo aumento em 70% do fluxo pulmonar e aumento na fH (frequência cardíaca) (Leite et al., 2013, 2014) Portanto, o nervo vago tem um papel significativo na regulação da resistência vascular pulmonar e hemodinâmica. 25 No coração, a modulação autonômica, além de definir a fH, determina as oscilações instantâneas no intervalo entre batimentos cardíacos consecutivos - intervalo R-R (RRi) (Task Force, 1996). O resultado dessa modulação ao longo do tempo é chamado de Variabilidade de Frequência Cardíaca (VFC) (Altimiras, 1999). A VFC está presente em peixes, anfíbios, répteis e mamíferos (Taylor et al., 1999, 2014; Zena et al., 2017; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Em peixes, a importância da modulação pelo nervo vago nas variações da atividade cardíaca foi atestada por Campbell e colaboradores (2006), que observaram após vagotomia em Myoxocephalus scorpius, elevação da fH e desaparecimento da VFC. Leite e colaboradores (2009) observaram que o nervo vago tem um papel predominante no controle da frequência cardíaca média e em variações de RRi em pacu, Piaractus mesopotamicus. Em anfíbios, Zena e colaboradores (2017) demonstraram a presença da VFC em sapos cururus. Além disso, foi observado que esses animais exibem interações cardiorrespiratórias viabilizadas por modulação vagal do coração acoplando o trabalho cardíaco aos ciclos ventilatórios. Modulações semelhantes foram observadas em cascavel (Sanches et al., 2019) e teiú (Duran et al., 2020) evidenciando que as modulações de VFC para produzir interações cardiorrespiratória foram mantidas ao longo da evolução. A vagotomia (física ou química) em cascavel, assim como em outros répteis resulta em taquicardia, perda da VFC e consequentemente de tais interações (Wang et al., 2001; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Essas modulações se desenvolvem ao longo do período embrionário uma vez que os receptores colinérgicos e adrenérgicos aparecem no coração no início do desenvolvimento (Taylor et al., 2014) refletindo o efeito de múltiplas influências autonômicas concomitantes sobre a fH de modo que que a existência e persistência da VFC reflete a ocorrência dos múltiplos processos autonômicos em um animal em repouso. A modulação autonômica também é responsável pelo mecanismo barorreflexo que atua na regulação rápida das flutuações da pressão arterial. Os barorreceptores, proprioceptores transmurais fásicos, são ativados pelo estiramento das paredes vasculares em decorrência das oscilações de pressão arterial ao longo de cada ciclo cardíaco. Sua ativação é processada centralmente e resulta em processos compensatórios que envolvem alterações de atividade cardíaca, alterações de resistência vascular periférica e do retorno venoso (Cowley et al., 1973; Kirchheim, 1976; Guyenet, 2006; La Rovere et al., 2008). Estudos com desnervação de barorreceptores demonstraram sua importância na regulação em parâmetros cardiovasculares com incapacidade de manutenção de níveis estáveis de 26 pressão arterial média (PAM) e fH (Lataro et al., 2010; Rodrigues et al., 2011; Armelin et al., 2016; Castania et al., 2019). A presença do barorreflexo foi relatada em diferentes classes de vertebrados, desde peixes, (Sandblom e Axelsson, 2005; Armelin et al., 2016; 2021), anfíbios (West e Van Vilet, 1994; Zena et al., 2015), répteis (Millard e Moali, 1980; Hagensen et al., 2010; Zena et al., 2016), aves (Smith, 1994) e mamíferos (Coleman, 1980; Silva et al., 2019). Em trabalho recente, Filogonio e colaboradores (2019) demonstraram a presença do barorreflexo em cascavéis e outros squamatas. Assim como a VFC, o mecanismo barorreflexo parece ter sido altamente conservado ao longo da evolução. Os barorreceptores de baixa pressão, localizados na artéria pulmonar, átrio e ventrículo, também fazem parte da regulação barorreflexa. Eles são ativados durante a distensão atrial e são sensíveis às alterações de volume sanguíneo (Zoller et al., 1972; Thrasher, 1994). Esse mecanismo e receptores já foram bem descritos em mamíferos (Hisdal et al., 2001; Oga et al., 2018). Infelizmente não há descrição desses barorreceptores em répteis. Dentre outros reflexos com influência hemodinâmica, destacamos o reflexo de Cushing. Este é amplamente descrito em mamíferos (McGilliduddy et al., 1978; Paton et al., 2009; Schmidt et. al., 2018), mas nenhum relato na literatura foi encontrado com descrição desse mecanismo em répteis. Por definição, este reflexo ocorre em resposta ao aumento da pressão intracraniana (PIC) e ocasiona aumento na pressão arterial. Esta tende a ser ajustada para um nível ligeiramente acima da PCI a cada momento. Há evidencias acerca do papel das catecolaminas nesta resposta. O aumento da PA pode ser mediado pela vasoconstrição α-adrenérgica e estimulação cardíaca β-adrenérgica (Galli et al., 2007). Esse reflexo é um importante recurso para preservar o tecido cerebral e evitar problemas de isquemia. Embora não se tenha determinado a localização exata dos centros que coordenam o reflexo de Cushing, há a hipótese de que o Núcleo do Trato Solitário seja o local onde os sinais são interpretados. Esta região participa do controle de funções respiratórias e outras regulações cardiovasculares. O mecanismo de transdução no tronco cerebral também permanece desconhecido. Pesquisadores acreditam que o mecanismo de Cushing compõe o grupo de reflexos que agem para a homeostasia da pressão arterial (McGilliduddy et al., 1978; Dickinson, 1990; Osborns, 2005; Paton et al., 2009; Schmidt et. al., 2018). 27 Outros mecanismos de curto prazo para regulação da PAM podem envolver diversos ajustes reflexos e possuem ação sobre o débito cardíaco (DC), alterando tanto fH quanto o volume de ejeção sistólica. Ou ainda, eles podem modular a contratilidade dos vasos, afetando o retorno venoso, ampliando ou reduzindo a complacência e resistência vascular, entre outros fatores (Guyton, 1955). Situações cotidianas ou patológicas, como em casos de hipotensão ou alteração postural, são controladas rapidamente pelos mecanismos barorreflexos. Outros fatores também são importantes. O mecanismo de Frank-Starling é um exemplo de um mecanismo não-reflexo que possui papel fundamental no controle cardiovascular. Pode se dizer que ele representa uma característica intrínseca do músculo cardíaco e é uma importante resposta fisiológica de curto prazo relacionada com a capacidade do coração em modificar sua contratilidade se adaptando às variações de retorno venoso. Quanto maior o volume a ser bombeado, maior a força de contração. Este mecanismo já foi descrito em peixes (Altimiras e Axelsson, 2004; Amelio et al., 2013; Imbrogno et al., 2014), anfíbios (Gleeson et al 1980; McKean et al., 1997; Hedrick et al., 1999), aves (Grubb, 1982; Peters et al., 2005), répteis (Gleeson et al., 1980; Franklin e Axelson, 1994; Franklin, 1994; Farrell et L., 1994; Wang et al., 2002; Keen et al., 2016) e mamíferos (Methawasin et al., 2014). Em cascavéis foi observado que o aumento do retorno venoso causado pela elevação do volume sanguíneo gerou um pequeno aumento no volume sistólico (Vstot). Contudo, foi experimentalmente demonstrado que o retorno venoso afeta fortemente o Vstot quando o volume de enchimento vascular é reduzido (ex.: em casos de depleção do volume sanguíneo). Este fato corrobora a conexão entre tais mecanismos (Skalls et al., 2005). A regulação da pressão arterial também está diretamente relacionada com a ativação e resposta dos quimiorreceptores periféricos. Esses receptores, localizados na carótida e no arco aórtico, são sensíveis à diminuição de O2, aumento do CO2 e queda de pH. Marshall (1994) destaca que os resultados de estudos com estimulação de quimiorreceptores podem ser conflituosos, especialmente dependendo das condições experimentais, como a utilização de ventilação mecânica ou não. A resposta primária da estimulação dos quimiorreceptores envolve taquicardia e vasoconstrição como efeito do aumento da atividade simpática. A resposta secundária com bradicardia e vasodilatação estão diretamente relacionadas com o reflexo causado pelos barorreceptores pulmonares em resposta à hiperventilação. Deste modo, a direção da mudança provocada pela estimulação dos quimiorreceptores carotídeos 28 tanto para resistência vascular periférica, como para a ƒH, pode ser fortemente influenciada pela mudança ventilatória. A vasoconstrição pode ser considerada uma resposta primária à estimulação dos quimiorreceptores carotídeos, enquanto que a vasodilatação pode ser considerada secundária à um aumento na ventilação (Smatresk, 1990; Marshall, 1994; Prabhakar et al., 2015). Em répteis os quimiorreceptores possuem distribuição diferente dos mamíferos. Eles receptores são compostos por um conjunto de células glomus localizadas ao redor da carótida e suas ramificações, aorta e artéria pulmonar (Marshall, 1994; Milson e Burleson, 2007; Taylor et al., 2010; Reyes et al., 2015). Denis e colaboradores (2004) demonstraram que cascavéis expostas a elevadas concentrações de CO2 apresentaram aumento na ƒH e PAM. As modulações e integrações do SNA possuem diferentes níveis de complexidade e muitos aspectos das interações do sistema nervoso encontrado em mamíferos parecem ter sido altamente conservados ao longo da evolução. A manutenção da homeostase corpórea exige que essas modulações funcionem em seu estado ótimo e a integridade dos componentes físicos que integram as respostas cardiovasculares é fundamental e, portanto, bom determinante de funcionamento do SNA. Embora a literatura seja ricamente abastecida com informações sobre os parâmetros cardiovasculares de cascavéis, a integração de múltiplos parâmetros desses animais em repouso merece maiores investigações. 1.3 Encéfalo reptiliano A estrutura básica do sistema nervoso central dos animais é bastante similar entre os grupos (Northcutt, 2002). Grande parte das estruturas cerebrais de répteis são homólogas a dos mamíferos (Northcutt, 1967, 1981, 2002; Bruce, 2007). O encéfalo dos répteis é composto pelo telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinhal, possuindo formato tubular e linearmente organizado (Wyneken, 2007). O telencéfalo inclui os bulbos olfatórios, pedúnculos olfatórios e hemisférios cerebrais. O diencéfalo é relativamente menor que o telencéfalo e suas estruturas se localizam mais ventralmente ao encéfalo e inclui o tálamo e hipotálamo, infundíbulo, e ainda pelas glândulas pituitárias e pineal. Na região do tálamo, está presente o quiasma óptico. Mesencéfalo é constituído pelo teto óptico (porção dorsal), o tegumento (porção ventral), aqueduto cerebral e terceiro ventrículo. Dorsalmente, o rombencéfalo está localizado entre o teto óptico até a medula espinhal. Ventralmente, a medula oblonga ou bulbo, e é composta pelo cerebelo, quarto 29 ventrículo e núcleo de alguns nervos cranianos, dentre eles, trigêmeo, facial, glossofaríngeo e nervo vago (Northcutt, 1967, 2002; Bruce, 2007; Wyneken, 2007; Naumann et al., 2015). Em répteis, o encéfalo também possui a barreira hematoencefálica, composta por meninges (Wyneken, 2007). O sistema nervoso pode ser estruturalmente dividido em sistema nervoso central e periférico. Funcionalmente, pode ser identificado o sistema nervoso autônomo (SNA). Sua estrutura se difere dos mamíferos, que possuem os nervos do SNA originados em regiões discretas (nervos simpáticos – região toracolombar e parassimpáticos- região crânio-sacral). Neste grupo, as raízes destes nervos surgem ao longo da estrutura da medula espinhal (Wyneken, 2007). 1.4 Estresse animal, dor e interferentes cirúrgicos O estresse pode ter diferentes determinantes em animais e pode se fazer presente em situações como, manuseio, diferentes condições ambientais, disponibilidade de água e comida, temperatura, medo, dor, vida social, dentre outros (Blanchard et al., 2001). Independente da sua origem, o estresse pode acarretar alterações em parâmetros hormonais, fisiológicos e/ou comportamentais (Edes et al., 2018). Ele não é necessariamente danoso, mas parte do mecanismo de preparação para mudanças. Parâmetros cardiovasculares, que dão suporte a alterações metabólicas e mudanças no nível de atividade, podem ser alterados frente ao estresse agudo, como foi observado em ratos submetidos a manuseio, contenção e imobilização. Nestes animais, a ƒH e PAM são elevadas nestas três diferentes manobras (Ondicova et al., 2019). O mesmo também foi observado sobre o estresse de manuseio em aves marinhas (Calonectris leucomelas). A ƒH é elevada após o contato e este parâmetro só retorna à valores basais após 90 minutos de repouso (Müller et al., 2017). Neste mesmo estudo, utilizando análise da VFC, os autores atribuíram os resultados à elevação na atividade simpática do SNA. Répteis também são susceptíveis às alterações fisiológicas decorrentes do estresse. Níveis plasmáticos de corticosterona têm sido um dos principais bioindicadores de estresse neste grupo (Guillette et al., 1995; Tyrrell e Cree, 1998; Moore et al., 2003). Captura e contenção em lagartos Urosaurus ornatos provocam diminuição nos níveis de testosterona e aumento na corticosterona (Moore et al., 1991). Nas serpentes Agkistrodon contortrix e 30 Pantherophis alleghaniensis, foi observado que o estresse de manuseio aumenta os níveis de lactato e diminuem o pH sanguíneo (Cerreta et al., 2020) Assim como o estresse, a nocicepção também é capaz de alterar respostas fisiológicas. Este é um ponto complexo e de difícil análise, pois a nocicepção, a percepção de dor, as sensações de medo e também o distresse causado por estas, apesar de comporem mecanismos diferentes, possuem sinergismo e podem facilmente se confundir (Morton e Griffiths, 1985; Bateson, 1991). Em humanos, o córtex pré-frontal e tálamo são responsáveis pelo processamento em interpretação dos estímulos que causam dor (Groh et al., 2018; Ong et al., 2019). As amígdalas cerebrais, pelo medo (Feinstein et al., 2011). A origem primitiva do diencéfalo e do sistema límbico, sua persistência em grupos mais recentes de vertebrados, assim como alguns estudos funcionais, indicam que grupos não-mamíferos devem compartilhar os mesmos locais de processamento de dor (Mathews, 2008; LeBlanc et al., 2016; Groh et al., 2018; Silva e Seminowicz, 2019) e medo (Maren et al., 2001; Phelps e LeDoux, 2005). A percepção de dor é de difícil caracterização devido a seu caráter subjetivo. Contudo, atualmente há protocolos estruturados sob conceitos éticos relevantes para analisar presença de dor, sua intensidade e suas consequências em parâmetros comportamentais e fisiológicos (Gatchel et al., 2007). Mamíferos, como: cachorros, gatos, coelhos e especialmente ratos e camundongos, são muito utilizados como modelo para o estudo da dor (Mogil, 2009; Jaggi et al., 2011). Em ratos, a dor aguda causada pela injeção de formalina na pata causa aumento na ƒH média por 30 minutos. Contudo, tal alteração não é acompanhada por variação na PAM (Santuzi et al., 2013). Alterações semelhantes na ƒH foram observadas por Charlet e colaboradores (2011). O aumento na ƒH acompanhada de redução de VFC foi observado camundongos após laparotomia sem tratamento analgésico pós-cirúrgico (Arras et al., 2007). Desta forma, parâmetros cardiovasculares, bem como indicador de funcionamento/modulação autonômica, são indicadores comumente utilizados para avaliar resposta à dor. A nocicepção pode ser definida como o mecanismo fisiológico de informação de lesões teciduais. Assim, ela envolve as vias pelas quais ocorre a percepção, transdução, transmissão e modulação dos sinais neurais gerados em resposta à um estímulo externo nocivo (Mosley, 2011; Perry e Nevarez, 2018). Os componentes neurais responsáveis pelo processamento/resposta de nocicepção têm sido descritos em répteis, em estudos mais 31 recentes (Stoskopf, 1994; Liang e Terashima, 1993; Machin, 2001). Comparações neuroanatomicas entre répteis e mamíferos sugerem que essa classe de animais possui estruturas que possibilitam a percepção da dor, embora esta seja subjetiva e possa variar de entre organismos e espécies (Mosley, 2011; Perry e Nevarez, 2018). Em estudo avaliando comportamento de resposta de tartarugas após injeção de formalina, Makau e colaboradores (2017) relataram que os animais aumentam consideravelmente o tempo de retirada do membro posterior após tensionamento muscular (as patas foram gentilmente esticadas com o uso de uma pinça) para quando comparada com os controles submetidos à injeções de salina ou dimetilsulfóxido, atestando a capacidade de sentir e reagir ao reflexo de dor causado pelo teste de formalina que atua via ativação direta das fibras nociceptoras. Com a finalidade de abolir efeitos estressores, percepção de dor, integração de estímulos nociceptores e também, para respeitar questões éticas de bem-estar animal, alguns experimentos mais invasivos são executados sob o efeito de anestesia terminal. Contudo, muitos parâmetros fisiológicos podem ser alterados por anestésicos. No início dos anos 50, a preocupação dos efeitos adversos de anestésicos no sistema cardiovascular em humanos, especialmente durante cirurgias, foi testada e descrita para diversas substâncias e dosagens. Diversos efeitos foram descritos e dentre eles eram recorrentes as alterações na frequência cardíaca, pressão arterial e mecanismo barorreflexo (Johnstone, 1951; Gross et al., 1951; Imig, 1953; Robertoson e Swan, 1957; Dundee e Black, 1960; Vatner, 1978). Uma ampla variedade de anestésicos já foi utilizada em animais experimentais, sendo a cetamina e xilazina muito usada em roedores (Zandieh et al., 2003); benzocaína e tricaína, em peixes e anfíbios (Stoskopf, 1994; Machin, 2001); pentobarbital e anestésicos inalatórios, tais como halotano, sevoflurano e isoflurano, em répteis (Stoskopt, 1994; Machin, 2001). Lee e colaboradores (2002) observaram que o anestésico isoflurano deprime o controle barorreflexo em roedores. Bagshaw e Cox (1982) relataram que o uso de óxido nitroso aumenta a atividade simpática eferente em cachorros. Blake e Korner (1982) observaram aumento na pressão arterial pelo efeito da cetamina em coelhos. Em répteis, estudos com cascavéis apontam que o uso do anestésico diminui o tônus vagal e eleva a atividade simpática, consequentemente aumentando a frequência cardíaca (Galli et al., 2005). Em tartarugas do deserto submetida ao sevoflurano, Rooney e colaboradores (1999), observaram diminuição nas pressões sistólica, diastólica e ventricular média, mas nenhuma alteração na frequência cardíaca. Assim, os anestésicos causam efeitos diversos na modulação cardiovascular e tais alterações devem ser consideradas a depender dos objetivos 32 da instrumentação. O efeito inibidor de anestésicos no Sistema Nervoso Central (SNC) e especialmente SNA, tem sido um limitante importante para a investigação de questões mecanísticas. 1.5 Descerebração O Guia para Cuidado e Uso de Mamíferos em Neurociência e Pesquisa Comportamental da Academia Nacional de Ciência de Washington (Nacional Research Council, 2003), argumenta que processos que envolvem lesão cirúrgica para descerebração eliminam a possibilidade de percepção de dor, o que evita a necessidade de anestesia geral. Por exemplo, a descerebração foi utilizada para ablação da sensação de dor em gatos separando e inativando o córtex cerebral e o tálamo (Silverman et al., 2005). Modelos diversos com o uso de descerebração tem sido utilizado em espécies de mamíferos para estudos neurológicos clínicos que visam compreender os mecanismos espinhais envolvidos com a dor crônica (Dobson e Harris, 2012). O procedimento de descerebração é utilizado desde antes de 1900 (Sherrington, 1898). Ao longo das décadas, os objetivos de sua utilização e as técnicas utilizadas foram sendo refinados. Experimentos acerca de rigidez muscular, avaliação posturais, reflexos, anestesia e respostas farmacológicas fazem parte das primeiras investigações utilizando a descerebração (Blake e Korner, 1982; Faber et al., 1982). A descerebração pode ser executada com uma grande diversidade de técnicas, como corte cirúrgico com bisturi e remoção manual do tecido remanescente, remoção por aspiração ou cauterização, ou lesão química (Dobson et al., 2012; Nakanishi e Whlan, 2012; Rocha et al., 2021). Também já foi denominado “descerebração”, a remoção dos hemisférios cerebrais (Fedde et al., 1977), do telencéfalo (Stehouwer, 1987; Uematsu e Todo, 1997) ou ainda, retirada do córtex, tálamo e hipotálamo (Faber et al., 1982). Em protocolos de descerebração, a eutanásia é definida no momento do procedimento. Este processo gera alteração irreversível e assim, após o procedimento os animais estarão em um processo de deterioração progressiva de suas funções. Assim, as funções fisiológicas remanescentes e o tempo para tal deterioração em cada tipo de procedimento e espécie, são os aspectos que definem a relevância e uso do modelo para experimentação. Como ponto em comum, todas as variações de procedimento têm como propósito, a obtenção de uma preparação experimental eutanasiada e recuperada dos efeitos 33 anestésicos e assim, com funcionamento dos sistemas fisiológicos suficientemente capazes de fornecer dados e ser utilizado em uma pesquisa, pelo tempo necessário (Silverman et al., 2005). 1.6 Cascavel A cascavel é uma serpente amplamente distribuída nas Américas. Na América do Sul, encontramos a espécie Crotalus durissus. No Brasil, essa espécie está presente em diferentes biomas como, cerrado, mata atlântica e caatinga. Ela encontra-se amplamente distribuída nos estados brasileiros (Wüster et al., 2005; Tozetti e Martins, 2008; Tozetti et al., 2009). Sua temperatura de preferência é 30º C (Filogonio et al., 2016) e possui comportamento de predação “senta-e-espera” (Whitford et al. 2018). Além de sua ampla distribuição, a espécie possui algumas características fisiológicas e morfológicas interessantes para a experimentação: o baixo metabolismo, a ampla faixa térmica de atuação, a ausência de divisão toraco abdominal e apêndices, são aspectos que facilitam a instrumentação e aumentam a persistência funcional de uma preparação. A divisão incompleta dos ventrículos, um único e extenso pulmão, a presença de saco aéreo, inervação pulmonar unilateral também são aspectos interessantes à investigação (Jensen et al., 2013; Filogonio et al., 2020; Taylor et al., 2009; Leite et al., 2013, 2014). Isso permite a abordagem de questões funcionais relevantes para a compreensão dos circuitos sistêmico e pulmonar e de seu funcionamento conjunto. A cascavel tem sido relevante à investigação funcional em squamatos. Há diversos estudos sobre seu metabolismo e hematologia (Andrade et al., 1997; Troiano et al., 2001; Arvedsen et al., 2005; Bovo et al., 2015) e fisiologia cardiovascular em diversas vertentes (Wang t al., 1998; Galli et al., 2004, 2005, 2007; Taylor et al., 2009; Leite et al., 2013, 2014; Filogonio et al., 2014, 2016, 2019a, 2019b, 2019c, 2020; Sanches et al., 2019; Rocha et al., 2021) o que nos permite ter ampla referência dos parâmetros analisados no presente trabalho. 34 Figura 4. Exemplar de Cascavel Sul Americana, Crotalus durissus. (Foto: Gustavo Marega Oda). A espécie possui a seguinte classificação sistemática: Reino: Animalia Filo: Cordata Classe: Reptilia Ordem: Squamata Subordem: Serpentes Família: Viperidae Gênero: Crotalus Espécie: Crotalus durissus (Linnaeus, 1758). O procedimento que avaliamos neste estudo é proposto para a investigação experimental de questões acerca da modulação cardiovascular no grupo dos Squamatos. Ele foi desenvolvido para lidar com a necessidade de instrumentação complexa e invasiva, com implantação de diversos sensores e sondas para monitoramento cardiovascular, em uma preparação com SNA funcional, sem os efeitos do processamento de estímulos de nociceptores ou os efeitos indesejados da anestesia sobre parâmetros cardiovasculares e suas regulações. O uso do animal descerebrado permite a captação de diversos parâmetros 35 concomitantemente (por exemplo, ventilatórios, cardiovasculares e metabólicos) uma vez que esse procedimento inativa o córtex cerebral e o tálamo mantendo o SNA intacto bem como todas as funções fisiológicas controladas por ele e, fundamentalmente, evitando dor e estresse podendo ser considerada uma alternativa para procedimentos realizados sob anestesia terminal (Silverman et al., 2005). Ainda de acordo com Silverman, após ablação do sistema tálamo-cortical, não há evidências que indiquem processamento central de qualquer dos reflexos envolvidos com nocicepção em mamíferos descerebrados. O uso da descerebração em répteis como modelo de estudo para processos fisiológicos pode ser uma excelente ferramenta para compreensão de mecanismos que atualmente são realizados sob efeito de anestesia. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral O objetivo do presente trabalho foi avaliar a capacidade de recuperação da modulação autonômica cardiovascular em Crotalus durissus após descerebração e instrumentação para determinar a viabilidade do modelo. 2.2 Objetivos específicos Determinar se o modelo é útil, por ser capaz de prover registro de múltiplas variáveis, de recuperar modulações autonômicas em nível similar ao de animais intactos; e viável para procedimentos de longo prazo, conseguindo manter tais capacidades por longo tempo após a eutanásia. • Estudar a representatividade dos dados gerados pelo modelo da cascavel descerebrada, avaliando a similaridade de seus parâmetros cardiovasculares em repouso e de modulações autonômicas complexas com dados obtidos de animais não descerebrados ou anestesiados. • Estudar sua viabilidade em prover registros de múltiplos parâmetros cardiovasculares por longo prazo. 36 • Analisar as condições para utilização do modelo, traçando o perfil de recuperação de parâmetros cardiovasculares e da modulação autonômica após descerebração; • Avaliar a duração do modelo, analisando a capacidade de modulação de resposta cardiovascular à desafios autonômicos longo tempo após a descerebração. 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Altimiras, J. e Axelson, M. Intrinsic autoregulation of cardiac output in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) at different heart rates. Journal of Experimental Biology, 207, 195–201 (2004). Altimiras, J. Understanding autonomic sympathovagal balance from short-term heart rate variations. Are we analyzing noise? Comparative Biochemistry Physiology Part A, 124, 447–460, (1999). Altimiras, J., Aissaoui, A., Tort, L. and Axelsson, M. Cholinergic and Adrenergic Tones in the Control of Heart Rate in Teleosts. How Should They be Calculated? Comparative Biochemistry Physiology, 118, 131–139 (1997). Amelio, D., Garofalo, F., Capria, C., Tota, B., and Imbrogno, S. Effects of temperature on the nitric oxide-dependent modulation of the Frank–Starling mechanism: the fish heart as a case study. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 164, 356–362 (2013). Andrade, D.V., Cruz-Neto, A.P. and Abe, A.S. 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Tal preparação amplia as possibilidades de registros concomitantes de variáveis em investigações complexas, dentro dos preceitos éticos, sem as alterações causadas pela anestesia terminal e, ainda assim, eliminando os processos de dor e estresse. Para atestar a funcionalidade do modelo e seu escopo de uso, é necessário avaliar se seus parâmetros cardiovasculares e ajustes autonômicos são equivalentes aos de um animal não descerebrado. Nesta investigação, comparamos os valores médios de múltiplas variáveis cardiovasculares em repouso entre a preparação descerebrada e serpentes não descerebradas e também, avaliamos a similaridade do barorreflexo, como indicador de um reflexo cardiovascular complexo de ação constante e rápida resposta. Assim, dois grupos, controle (GC) e preparação descerebrada (GD), após canulação oclusiva da artéria vertebral, tiveram registrados a pressão arterial (PAM) e frequência cardíaca (fH) por 6h diárias após a cirurgia, durante 72h. O barorreflexo foi avaliado ao longo do tempo pelo monitoramento das variáveis operacionais obtidas pelo método da sequência (ganho operacional, BEI, número de sequências barorreflexas e número de rampas). Após 72h, o método farmacológico de acesso ao barorreflexo foi utilizado para analisar capacidades e limites deste mecanismo. Estabilização da fH média (bpm) ocorreu dentro de 24h em ambos os grupos (GC - 30,4 ± 1,41 e GD - 38,19 ± 3,61). A PAM (kPa) alcançou à valores estáveis em 24h em GC (4,34 ± 0,26) e 48h em GD (3,44 ± 0,18). O ganho operacional (ms·kPa-1) estabilizou em 54h em GC (2502 ± 192,2) e 48h em GD (2082 ± 290,1). O BEI não se alterou ao longo do tempo, indicando que sua manutenção era recuperada com a saída da anestesia. Além disso, os valores máximos de Ganho barorreflexo (G50) também foram equivalentes entre os grupos (2097 ± 920, controle e 1267 ± 516, descerebrados). GC e GD mantiveram os parâmetros cardiovasculares em valores similares e apresentaram perfis de recuperação de modulação autonômica semelhantes. Assim, a cascavel descerebrada possui ajustes equivalentes aos obtidos em animais não descerebrados atestando sua relevância para estudo de modulação cardiovascular. Palavras chave: descerebração, cascavel, barorreflexo, modelo experimental, cardiovascular, sistema nervoso autônomo. 46 1. Introdução O sistema cardiovascular possui arranjo complexo com interações dinâmicas de múltiplos órgãos. Estes operam sob um grande número de reflexos e interações modulatórias. Estudar tal complexidade eventualmente requer a aquisição e integração de diversos parâmetros cardiovasculares ou a investigação de um fenômeno em múltiplos níveis. O uso consistente de diversas plataformas experimentais in vivo, in situ, ex vivo, in vitro ou in sílico têm fornecido suporte experimental para a descrição de diversos mecanismos e funções em animais. Muitas vezes, um alto nível de invasividade instrumental é necessária para o registro de parâmetros cardiovasculares. Eventualmente, o nível de instrumentação proposto pode estar além do limite adequado para um procedimento aplicado in vivo. Essa é uma limitação relevante, mesmo com a utilização de novas ferramentas modernas e miniaturizadas de monitoramento cardiovascular. Assim, é comum que as investigações sobre a modulação autonômica cardiovascular usem experimentos in situ, com registros “open chest” (Galli et al., 2005a; Galli et al., 2005b; Mosley et al. 2004; Skals et al., 2005; Skovgaard et al., 2005; Taylor et al., 2009). Tais abordagens in situ foram altamente valiosas para gerar dados simultâneos de múltiplos parâmetros. Elas foram essenciais para a investigação dos mecanismos básicos que operam à modulação cardiovascular. Contudo, devido à interferência dos anestésicos utilizados no funcionamento nervoso, é difícil acessar os mecanismos modulados pelo sistema nervoso autônomo (SNA). Recentemente, foi sugerido um novo modelo experimental usando uma cascavel descerebrada para fornecer uma preparação pós-eutanásia com modulação autonômica funcional sobre o sistema cardiovascular (Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021). O uso deste modelo permitiu registros concomitantes de vários parâmetros cardíacos e vasculares após a remoção da anestesia. Essa preparação foi apontada como possivelmente relevante para estudos modulatórios (Rocha et al., 2021). No entanto, a extensão de sua aplicação depende da similaridade ou correspondência das respostas cardiovasculares autonômicas fornecidas com aquelas de animais intactos. O presente estudo fará uma avaliação quantitativa objetiva do novo modelo da cascavel descerebrada analisando um ajuste cardiovascular complexo modulado pelo SNA. Desta forma, utilizamos o barorreflexo como bioindicador de uma funcionalidade 47 autonômica complexa e comparamos o progresso de sua recuperação pós-instrumentação e o nível de sua atividade entre preparações descerebradas e cascavéis em repouso. O barorreflexo é o principal reflexo cardiovascular para tamponar eventuais flutuações da pressão arterial (Bagshaw, 1985; Guyenet, 2006). Ele é um mecanismo com elevado grau de complexidade que faz monitoramento permanente e constante com rápidos ajustes da pressão arterial. Este mecanismo monitora a pressão com receptores físicos transmurais nas paredes das principais artérias sistêmicas, integra tais informações centralmente com diversas outras influências centrais e periféricas e também, efetiva correções rápidas que envolvem ajustes de função cardíaca e em diversas seções vasculares. Desta forma, indicamos que o barorreflexo pode funcionar como um indicador sólido para avaliar a recuperação pós-cirúrgica da modulação autonômica cardiovascular. 2. Material e métodos 2.1 Animais experimentais Os exemplares de cascavéis Sul Americanas, Crotalus durissus, utilizadas (n = 16, massa corporal: 687,94 ± 61,93 g, média ± EPM) foram doadas pelo Instituto Butantan. Antes dos experimentos, as serpentes foram mantidas em recipientes individuais (56 × 38 × 20 cm), em sala com temperatura controlada, à 28 ± 2°C, sob fotoperíodo 12:12, com abastecimento de água ad libitum, e alimentadas com camundongos a cada 15 dias. A alimentação foi interrompida 15 dias antes dos experimentos. Todos os procedimentos e protocolos foram previamente analisados e aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEUA-UFSCar). 2.2 Preparação animal e descerebração O protocolo de descerebração foi descrito em detalhes por Rocha e colaboradores (2021). Em suma, cada animal foi inicialmente sedado por aumento de PCO2 (Wang et al., 1993; Leite et al. 2013, 2014) até que perdessem o controle motor, o que permitiu manuseio seguro e intubação para ventilação mecânica com 3-5% de anestésico inalável isoflurano (5% para indução por 5 minutos e 3% para manutenção da anestesia), 3-5 respirações por 48 minuto (volume corrente - 30 ml × kg-1) (Bertelsen et al., 2014). Sob anestesia, realizamos uma incisão rostro-caudal medial (~ 0,5 cm) no dorso da cabeça para expor o crânio. Uma pequena abertura medial (~ 2-3 mm) permitiu acessar as meninges logo acima do teto óptico. A artéria subjacente e qualquer eventual vaso colateral foram cauterizados e as meninges abertas. Uma sonda de cauterização foi usada para fazer uma incisão dorsoventral através do tecido cerebral na posição da terceira porção caudal do lobo óptico. Todo o sistema nervoso rostral àquela secção foi cauterizado e removido. Todas as estruturas neurais referentes ao cerebelo, tronco encefálico e porção posterior do hipotálamo permaneceram intactas. A cavidade restante foi preenchida com algodão estéril para estabilização do tecido remanescente. A descerebração, como um procedimento irreversível que proporciona um estado irrecuperável, foi declarada como sendo o momento da eutanásia, e a preparação descerebrada resultante foi utilizada no estudo do barorreflexo (Silverman et al., 2005; Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021). Todas as diretrizes éticas para a instrumentação animal continuaram sendo respeitadas enquanto a preparação estava em uso, mesmo após a descerebração. Ao final da cirurgia os animais receberam tratamento profilático com injeções de antibiótico (Enrofloxaxina 11mg·kg-1) e anti-inflamatório (Flunixina meglumina 1,1 mg·kg-1). 2.3 Instrumentação para o barorreflexo Preparações descerebradas (n = 8) foram canuladas sob o mesmo plano anestésico da cirurgia de descerebração. Uma incisão ventrolateral direita (~ 4,5 cm), rostral à posição do coração expôs a vasculatura central. A canulação oclusiva da artéria vertebral (cânula de polietileno PE50) forneceu acesso ao arco aórtico direito para registros de pressão arterial sistêmica (Psis). Os cateteres foram preenchidos com solução salina heparinizada (50 UI/ml, 0,9%). As cascavéis não descerebradas (n = 8) passaram pelo mesmo procedimento (incluindo duração da anestesia) sem o processo de descerebração. Após a cirurgia, a anestesia foi retirada e as preparações descerebradas e as cascavéis não descerebradas foram realocadas em caixas plásticas e mantidas em câmara climatizada à 30°C. 49 2.4 Registros e protocolo experimental Os registros cardiovasculares foram iniciados imediatamente após a cirurgia (taxa de amostragem, 1k·seg-1 - software Powerlab/LabChart®, ADInstruments). Para isso, os cateteres foram conectados a transdutores de pressão (Baxter Edward PX600), acoplados a pré-amplificadores de sinal (Bridge Amp, ADInstruments). Os transdutores de pressão foram calibrados contra uma coluna de água. Os sinais de pressão foram registrados por 6h diariamente e amostras ao longo deste período foram utilizadas para as análises. Estes dados foram utilizados para caracterizar o perfil de recuperação da frequência cardíaca média (fH) e pressão arterial média (PAM). Com os mesmos registros, utilizamos o Método da Sequência para descrever o barorreflexo operacional ao longo do tempo de recuperação (Filogonio et al., 2019). Após observação inconteste da estabilização do barorreflexo, foi realizado um protocolo farmacológico (n=6 para cada grupo) para análise dos limites funcionais do ganho barorreflexo. O protocolo foi constituído de injeções intravasculares seriadas com doses crescentes do agonista vasoconstritor α1 ‐ adrenérgico, fenilefrina (1; 2,5; 5; 10 e 25 μg·kg- 1), e do vasodilatador doador de óxido nítrico, nitroprussiato de sódio (1; 2,5; 5; 10 e 25 μg·kg-1). Tanto a ƒH média quanto PAM retornaram a uma linha de base estável antes da próxima injeção. Após protocolos experimentais, cada preparação e cascavel não descerebrada receberam injeção intravascular de barbitúrico (Tiopental, 100 ml·kg-1- Pearson, Brasil) seguido de solução hiper saturada de KCl. 2.5 Análises barorreflexas Consideramos como recuperação, o estabelecimento da estabilidade dos parâmetros do barorreflexo após a cirurgia. O Método da Sequência foi utilizado para acessar as alterações barorreflexas ao longo do tempo. As comparações entre a preparação descerebrada e grupo controle utilizaram as médias dos parâmetros cardiovasculares e do barorreflexo após a recuperação. A frequência cardíaca média (ƒH) e o respectivo intervalo de pulso (IP) foram derivados do sinal da pressão arterial. A pressão arterial sistêmica média foi calculada como PAM = 1/3 (Psistólica) + 2/3 (Pdiastólica). Os parâmetros do barorreflexo operacional foram calculados com método da sequência utilizando séries sequenciais de 300 ciclos cardíacos, 50 com valores de pressão sistólica e RRi extraídos do sinal de pressão arterial registrado (LabChart - AD Instruments) e analisado com software CardioSeries (v2.7, www.danielpenteado.com), de acordo com Filogonio e colaboradores (2019; 2020). A sensibilidade do barorreflexo (BRS), representada pelo ganho operacional (Gop), foi calculada como os valores médios da inclinação das sequências barorreflexas detectadas em cada fragmento analisado. O índice de eficiência barorreflexa (BEI) foi calculado como a proporção entre o número de sequências barorreflexas e o número total de rampas (Di Rienzo, et al., 2001 e Filogonio et al., 2019): 𝐵𝐸𝐼 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑞𝑢ê𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 𝑏𝑎𝑟𝑜𝑟𝑟𝑒𝑓𝑙𝑒𝑥𝑎𝑠 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑚𝑝𝑎𝑠 O ganho máximo (G50) foi derivado do Método Farmacológico e calculado por uma função sigmoide não linear de quatro parâmetros (Reid, 1996): 𝐼𝑃 = (𝐼𝑃𝑚𝑎𝑥 − 𝐼𝑃𝑚𝑖𝑛) 1 + ( 𝑃𝐴𝑀 𝐶 ) 𝐵 + 𝐼𝑃𝑚𝑖𝑛 onde B é o coeficiente de inclinação (ou seja, inclinação máxima da porção linear da curva). C é PAM no ponto médio do intervalo entre IP máximo e mínimo, de acordo com Filogonio et al., (2019). G50 foi calculado de acordo com Crossley e colaboradores (2015) como: 𝐺50 = | −𝐵(𝐼𝑃𝑚𝑎𝑥 − 𝐼𝑃𝑚𝑖𝑛) 4𝐶 | 2.6 Análise estatística Comparamos os valores médios sequenciais das variáveis barorreflexas ao longo do tempo após a cirurgia (Gop, BEI, número de sequências barorreflexas, número total de rampas, PAM, ƒH médio) para cada grupo experimental usando ANOVA One-Way para medidas repetidas/Sidak ou Friedman/Dunn. Utilizamos One-Way ANOVA/Tukey para 51 comparar os parâmetros do barorreflexo no início da recuperação e no final do protocolo experimental. Utilizamos o teste Two-Way ANOVA/Tukey para comparar os parâmetros barorreflexos entre preparações descerebradas e cascavéis não descerebradas (controle) após estabilização. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) (p <0,05; GraphPad Prism 7.0). 3. Resultados 3.1 Barorreflexo ao longo do tempo A recuperação foi definida após a estabilização dos valores médios dos parâmetros cardiovasculares e do barorreflexo quando comparados com os valores logo após a cirurgia (tempo 0). Os primeiros registros feitos imediatamente após a cirurgia representam valores dos animais ainda sob anestesia e evidenciam nível semelhante de variáveis cardiovasculares e barorreflexas entre os grupos experimentais (Fig. 1 e 2). O efeito da anestesia durou mais de 6h após o final do procedimento. Depois disso, houve progressão de recuperação semelhante entre os grupos experimentais (Fig. 1 e 2). As médias de ƒH e PAM estabilizaram 24h após a cirurgia no GC (Fig. 1 A e B). Contudo, o Gop levou 54h para atingir valores estáveis. Os valores BEI foram semelhantes ao valor médio de recuperação logo após a cirurgia em ambos os grupos (Fig. 1 C e D). O GD também recuperou a ƒH média em 24h, porém a PAM levou mais tempo para reduzir à valores estáveis (Fig. 2 A e B). Após a cirurgia, Gop se elevou e se estabilizou após 48h, assim como a PAM. O BEI se manteve estável desde o início das medidas (Fig. 2 C e D). 52 Figura 1. Parâmetros cardiovasculares e barorreflexos ao longo do tempo após cirurgia em cascavéis, Crotalus durissus. Os valores foram obtidos pelo Método da Sequência de análise barorreflexa. (a) frequência cardíaca - ƒH; (b) pressão arterial média - PAM; (c) ganho barorreflexo operacional - Gop; (d) índice de eficiência barorreflexa - BEI. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam diferença estatística (One-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 8). 53 Figura 2. Parâmetros cardiovasculares e barorreflexos ao longo do tempo após cirurgia em cascavéis descerebradas, Crotalus durissus. Os valores foram obtidos pelo Método da Sequência de análise barorreflexa. (a) frequência cardíaca - ƒH; (b) pressão arterial média - PAM; (c) ganho barorreflexo operacional - Gop; (d) índice de eficiência barorreflexa - BEI. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam diferença estatística (One-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 8). 3.2 Cascavel não descerebrada x preparação descerebrada após estabilização Após estabilidade dos valores médios dos parâmetros cardiovasculares e barorreflexos de ƒH, PAM, Gop serem alcançados, em cada grupo experimental, estes permaneceram estáveis até o final do protocolo experimental (Tabela 1). 54 Tabela 1. Valores médios dos parâmetros cardiovasculares e do barorreflexo no estabelecimento da recuperação e ao final do protocolo experimental. Os valores foram obtidos com o Método da Sequência de análise barorreflexa. Parâmetro barorreflexo Estabelecimento da estabilização Fim do experimento Controle Descerebrado Controle Descerebrado ƒH (bpm) 30,4 ± 1,41a 38,19 ± 3,61a 28,95 ± 2,44a 38,41 ± 4,39a PAM (kPa) 4,34 ± 0,26a 3,44 ± 0,18a 3,56 ± 0,26a 3,40 ± 0,30a Gop (ms. kPa-1) 2502 ± 192,2a 2082 ± 290,1a 2147 ± 221,5a 1679 ± 272,4a BEI 0,29 ± 0,01a 0,48 ± 0,04a 0,40 ± 0,04a 0,48 ± 0,04a Os valores são médias ± EPM. ƒH - frequência cardíaca; PAM - pressão arterial média; Gop - ganho do barorreflexo operacional e BEI - índice de eficiência barorreflexa. Letras diferentes denotam valores diferentes. (Two-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 8). Os ganhos operacionais e máximo foram semelhantes. Os valores médios de Gop e G50 foram 2147 ± 221,5 e 2097 ± 920, no GC; e 1679 ± 272,4 e 1267 ± 516, no GD, respectivamente, indicando que a estabilidade foi alcançada após a cirurgia. Gop e G50 não foram diferentes entre os grupos experimentais (Fig. 3). Figura 3. Valores do barorreflexo entre os grupos experimentais, cascavéis não descerebradas e preparações descerebradas após a recuperação. A - Valores médios de ganho barorreflexo operacional (Gop) e ganho barorreflexo máximo (G50), 72h após a cirurgia: coluna preta - cascavéis não descerebradas; coluna cinza - preparações descerebradas. B - Curvas barorreflexas sigmoides médias obtidas com o método farmacológico: linha preta - cascavéis não descerebradas; linha cinza - preparações descerebradas. Setas pontilhadas indicam Gop. Setas contínuas indicam G50. Os valores são médias ± EPM. Letras diferentes denotam valores diferentes. (Two-Way ANOVA/Tukey; P <0,05; n = 6). 55 4. Discussão Recentemente, uma preparação de cascavel descerebrada foi validada e utilizada para investigar questões relacionadas ao papel do NO na modulação do sistema cardiovascular (Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021). Essa preparação demonstrou ser capaz de gerar ajustes cardiovasculares complexos em resposta à diversos desafios hemodinâmicos, e estímulos à quimiorreceptores de O2 e temperatura (Rocha et al., 2021). Parte das respostas cardiovasculares descritas diferiram daquelas obtidas com preparações anestesiadas in situ (Castro et al., 2021; Galli et al., 2005b). No entanto, apesar de ser relatado como uma importante ferramenta para pesquisa experimental, a relevância prática desse modelo é impactada pela semelhança de suas respostas autonômicas com as de serpentes não descerebradas. Infelizmente, tal comparação é limitada, pois não é possível submeter uma serpente não descerebrada ao mesmo nível de instrumentação mantida por uma preparação descerebrada. Assim, focamos nossas análises na similaridade dos parâmetros de repouso e no barorreflexo. Este é um mecanismo complexo, dinâmico e bem conhecido. Ele pode modular uma série de ajustes cardíacos e vasculares que podem ser monitorados com instrumentação mínima (canulação da artéria vertebral). Em seguida, utilizamos a recuperação do barorreflexo pós-instrumentação para indexar a recuperação da modulação autonômica sobre o sistema cardiovascular. Além disso, esse índice foi usado para verificar a semelhança das respostas cardiovasculares entre serpentes não descerebradas e preparações descerebradas. Ambos os grupos recuperaram níveis semelhantes de respostas barorreflexas, indicando que a preparação do animal descerebrado pode fornecer dados confiáveis e representativos sobre os mecanismos autonômicos. O barorreflexo como índice de recuperação Em vertebrados, a PAM opera sob grandes influências tanto do débito cardíaco quanto da resistência vascular periférica. Embora a PAM seja relativamente constante ao longo do tempo, a pressão arterial instantânea tende a flutuar devido a diversos fatores, como ventilação, mudança de temperatura, níveis de atividade, ortostase e vários outros (Armelin et al. 2014, Filogonio et al., 2020; Wang et al., 2019; Van Vliet e West, 1987; Zena et al., 56 2015). O barorreflexo é o principal reflexo cardiovascular para estabilizar eventuais flutuações da pressão arterial (Bagshaw, 1985; Guyenet, 2006). Sua relevância para a manutenção hemodinâmica é atestada por sua preservação através da linhagem de vertebrados (Bagshaw, 1985; Van Vliet e West, 1994; Armelin et al., 2021). Esse mecanismo foi experimentalmente evidenciado em todos os grupos de vertebrados, como peixes (Sandblom e Axelsson, 2005; Armelin et al., 2016; 2021), anfíbios (West e Van Vilet, 1994; Zena et al., 2015), crocodilo (Hagensen et al., 2010), quelônios (Millard e Moali, 1980); squamatos (Filogonio et al., 2019; Zena et al., 2016), aves (Smith, 1994) e mamíferos (Coleman, 1980). Portanto, a expressão de mecanismo tão relevante é adequada para indexar a presença e magnitude da modulação cardiovascular no presente estudo. Nossos resultados indicam que o SNA está operando em nível adequado para a manutenção dos parâmetros cardiovasculares e para a modulação de respostas autonômicas. No entanto, devemos ponderar que o barorreflexo, tal como utilizado aqui, é um índice. Ele não reflete a expressão de todas as possíveis influências modulatórias sobre o sistema cardiovascular. A abordagem utilizada é adequada, pois permite uma comparação qualitativa e quantitativa entre grupos experimentais. Contudo, ela possui limites. Não devemos considerar que a preparação descerebrada seja igual ao animal não descerebrado. A preparação descerebrada não possui interação entre estruturas neurais superiores e o SNA. Além disso, espera-se que a capacidade modulatória se deteriore com o tempo na preparação descerebrada. Assim, dentro do presente contexto, é muito relevante que os parâmetros tenham sido observados em recuperação e estabilização ao longo de dias. Para que a confiabilidade do presente modelo seja determinada e sua utilização definida, foi importante investigar se ajustes cardiovasculares complexos estavam presentes e se eram realizados no mesmo nível ao longo do tempo de experimentação. Os processos de instrumentação atenuaram o barorreflexo, e ambos os grupos experimentais apresentaram parâmetros cardiovasculares médios e Gop alterados após a cirurgia. O efeito depressivo da anestesia sobre o sistema autonômico pareceu ser de grande relevância, uma vez que ambos os grupos, apesar de instrumentação muito diferente (descerebração+canulação x canulação), tiveram magnitude semelhante de alterações cardiovasculares. É sabido que os anestésicos interferem no SNA e podem causar efeitos confusos e, às vezes contraditórios, nos parâmetros cardiovasculares (Hettrick et al., 1996; Rooney et al., 1999; Mosley et al., 2004; Taylor et al., 2009; Williams et al., 2018). A atenuação do barorreflexo sob anestesia foi relatada anteriormente para diferentes grupos de 57 vertebrados. O isoflurano e o enflurano diminuíram PAM, ƒH e atividade do mecanismo barorreflexo em ratos (Lee et al., 2002; Lee et al., 2004). Em humanos, o isoflurano e o sevoflurano reduziram a sensibilidade barorreflexa, mas tiveram recuperação completa 2 horas após a suspensão da anestesia (Nagasaki et al., 2001). Não há relatos de recuperação barorreflexa após a exposição à anestésicos inalatórios em outros animais. Para outros anestésicos foi observado que ratos levam 5-6 horas para recuperar o barorreflexo após anestesia com pentobarbital sódico, 4 horas após cloral hidratado e 4-5 horas, após protocolo anestésico com Diazepam/Cetamina (Ming et al., 2004). Foi observado que o isoflurano aumentou a ƒH em cascavéis e lagartos teiú como seu efeito sobre o equilíbrio autonômico, causando grande queda da modulação parassimpática (Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Infelizmente, não há descrição da recuperação pós-cirúrgica do barorreflexo em outras espécies de vertebrados não mamíferos. Adicionalmente, observamos que animais controle recuperaram a ƒH e PAM médias (24h) antes do barorreflexo. Isso foi observado porque o Gop demorou mais para se restabelecer totalmente (54h). Tal informação possui grande relevância, uma vez que estudos dedicados à investigação de mecanismos modulatórios devem validar a presença e funcionalidade do mecanismo de interesse na condição experimental. Recuperação barorreflexa Os parâmetros cardiovasculares foram estabelecidos como estáveis, 48 horas após a instrumentação. Além disso, ambos os grupos tiveram perfis de recuperação semelhantes ao longo do tempo para as variáveis barorreflexas. Utilizamos o método de sequência para análises barorreflexas, o que permitiu análises sequenciais ao longo da duração do protocolo. É razoável assumirmos que, mesmo observando uma recuperação autonômica, a preparação não é um animal íntegro e, portanto, menores variações de pressão podem refletir menores interferências nos parâmetros hemodinâmicos, como estado de alerta, atividade, e outros fatores que exercem influências sobre a estabilidade do sistema cardiovascular. O método de sequência possibilitou o registro de outros parâmetros importantes, como BEI. Sua diminuição indicaria menos eficácia do barorreflexo em recrutar o ƒH para compensações de pressão, e seu aumento seria o oposto. Portanto, sua estabilidade ao longo do tempo é surpreendentemente interessante e indica que os outros reflexos e processos modulatórios que disputam o controle da ƒH também estão reduzidos após a instrumentação 58 e, provavelmente, se recuperam junto ao controle da pressão arterial. Este resultado sugere certo equilíbrio modulatório entre os processos autonômicos. Se tal interpretação estiver correta, nossos resultados indicam que esse equilíbrio está presente e é mantido na preparação descerebrada. Similaridade barorreflexa Durante o método de descerebração, as vias aferentes e eferentes e áreas de integração central para o barorreflexo foram mantidas, como os nervos cranianos, o núcleo do trato solitário, bulbo ventrolateral caudal e bulbo ventrolateral rostral (Guyenet, 2006; Robertson et al.,2012). Com base na similaridade de Gop, BEI, G50, entre grupos experimentais, podemos assumir que o barorreflexo está trabalhando de forma eficiente em toda a sua faixa operacional na preparação descerebrada. Tal resultado em animais descerebrados também indica que há pouca influência das áreas superiores do córtex interferindo no barorreflexo em cascavéis em repouso, a 30ºC. O protocolo farmacológico também atestou a capacidade da preparação descerebrada em manter a resposta barorreflexa após interferências hemodinâmicas (Filogonio et al., 2019; Armelin et al., 2021). No presente estudo, realizamos o protocolo farmacológico somente após a verificação da recuperação. Naquele momento, o ganho operacional e o ganho máximo foram semelhantes em ambos os grupos. A estabilização do barorreflexo foi mantida até 72h, indicando que a capacidade recuperada da modulação autonômica não decai ao longo desse tempo experimental. Essa é uma informação muito relevante. De acordo com os dados presentes, os projetos experimentais futuros podem ser tão longos quanto o protocolo atual. Pode ser útil abordar a duração da preparação do animal descerebrado ao longo do tempo. No entanto, isso exigiria um protocolo experimental dedicado e deveria envolver outros parâmetros cardiovasculares. Parâmetros cardiovasculares durante a recuperação Os grupos experimentais recuperaram a estabilidade dos valores médios dos parâmetros cardiovasculares 24h após a cirurgia, porém o Gop demorou 48h para aumentar e se estabilizar. Estabelecer o tempo adequado para a recuperação pós-cirúrgica é fundamental em qualquer projeto experimental para estudos in vivo. Essa questão é ainda 59 mais relevante se o protocolo envolver anestésicos e animais ectotérmicos. A anestesia pode durar tempo variável de acordo com: o tipo de anestésico, sua dosagem, massa corporal do animal, metabolismo do animal e tempo de instrumentação (Misal et al., 2016). Vertebrados ectotérmicos podem variar seu metabolismo em uma ampla faixa, de acordo com a temperatura ou estágio de desenvolvimento (Ligon et al., 2012; Leite et al., 2013, 2014). Portanto, a recuperação da anestesia é uma questão especial na instrumentação nestes animais. Esse argumento é relevante, pois em biologia experimental é comum apontar a estabilidade das médias de ƒH ou PAM para indicar o restabelecimento em repouso e atestar a recuperação de animais em experimento in vivo (Porges et al., 2003; Taylor et al., 2009; Hedrick et al., 2015). Nosso experimento indica que os valores médios de ambas as variáveis podem se recuperar antes do mecanismo barorreflexo e sugerimos que esse fato deve ser considerado quando as investigações abordarem os mecanismos regulatórios. Diferenças entre o tempo de recuperação dos parâmetros cardiovasculares médios e indicadores de função autonômica foram observadas anteriormente em cascavéis (Sanches, et al., 2019) e lagarto teiú (Duran et al., 2020). Essa recuperação depende da espécie e, obviamente, espera- se que seja fortemente afetada pela qualidade da instrumentação, protocolo de anestesia e temperatura. Embora a recuperação total da capacidade de modulação autonômica não seja necessária para parte das investigações experimentais, o uso de índices reducionistas, como ƒH e PAM médias, deve ser considerado com bastante cautela. 5. Considerações Finais Preparações descerebradas têm sido uma ferramenta útil para estudos mecanísticos em várias áreas das ciências fisiológicas. Diversos níveis de descerebração foram desenvolvidos em várias espécies, como ratos (Gringson et al., 1997; Nakanishi e Whelan, 2012), coelhos (Clarke e Harris, 2001), gatos (McWilliam et al., 1991; Montano et al, 1992), sapos (Wang et al., 1999), peixes (Uematsu e Todo, 1997), de acordo com o estudo (por exemplo, nocicepção, função reflexa, comportamento, anestesia e muitos outros - Woods, 1964; Lee et al., 2002 ; Lee et al. 2004; Pickering e Paton, 2006; Meehan et al., 2017). A metodologia de descerebração utilizada neste estudo procede à eliminação da estrutura cerebral rostral ao teto óptico e mantém o núcleo dos centros autonômicos (Rocha et al., 60 2021; Castro et al., 2021). Isso elimina a ativação do córtex cerebral e do tálamo, que são estruturas essenciais para o processamento de estímulos dolorosos e distresse (Silverman et al. 2005). Além disso, por ser um processo irreversível, resultado de uma preparação funcionalmente limitada no tempo, este procedimento é considerado o momento da eutanásia (Silverman et al., 2005; Rocha et al., 2021). A baixa taxa metabólica de repouso da cascavel pareceu auxiliar no prolongamento do tempo de decadência. A combinação desses fatores alterou o limite de duração da preparação descrevendo uma ferramenta interessante para estudos cardiovasculares. O presente estudo indica que a preparação descerebrada foi capaz de recuperação pós-cirúrgica e manutenção da ƒH e PAM médias ao longo de 72h. Também foi capaz de modular a variação espontânea da pressão e também ajustar as alterações de pressão induzidas farmacologicamente na mesma magnitude das serpentes não descerebradas. Portanto, consideramos que esta preparação é capaz de produzir resultados representativos em investigações mecanísticas acerca da modulação autonômica do sistema cardiovascular. 6. 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A preparação possibilita instrumentação para registro concomitante de vários parâmetros cardiovasculares sob modulação autonômica adequada. O lento decaimento de funções modulatórias foi apontado como um ponto relevante desta preparação. Contudo, tal suposição foi baseada em dados iniciais e sem a devida validação no tempo. A relevância e confiabilidade do modelo está, dentre outras coisas, relacionada ao tempo em que permanece viável e funcional, após a descerebração. Desta forma, nosso objetivo foi testar sua viabilidade pela análise da permanência de modulações autonômicas em longo prazo. Assim, analisamos a manutenção da estabilidade de parâmetros cardiovasculares em preparação instrumentada ao longo do tempo (dias) e o nível de modulação autonômica pela presença de indexadores de reflexos cardiovasculares complexos, como a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) e barorreflexo (BaR). As variáveis cardiovasculares analisadas (frequência cardíaca, pressão arterial média sistêmica e pulmonar, fluxos sanguíneos sistêmico e pulmonar, condutâncias vasculares sistêmica e pulmonar, débito cardíaco e volume sistólico total) foram mantidas na condição de repouso esperada para a espécie por 15 dias após a descerebração. Da mesma forma, o BaR que estava presente e foi equivalente ao relatado para cascavéis em repouso (Ganho operacional, 1.130,0 ± 229,7 ms·kPa-1). Além disso, as preparações descerebradas demostraram reestabelecimento da VFC em repouso, indicada definidas pelo valor de PSD (Power Spectral Density, 186.834 ± 108.520 ms2). A presença dessas variáveis e o funcionamento das mesmas, em níveis semelhantes à animais intactos, denotam a recuperação e manutenção da modulação autonômica da atividade cardíaca pelo SNA e demonstram que o modelo é apto para ser utilizado em experimentos no estado de repouso e apresenta potencial para testes mais complexos que exijam maiores níveis de regulações das variáveis cardiovasculares. Palavras-chave: sistema nervoso autônomo, variabilidade da frequência cardíaca, barorreflexo, Crotalus durissus, descerebração. 66 1. Introdução Reptilia é uma classe polifilética que parece conservar aspectos fundamentais da história dos vertebrados. Compreender os sistemas circulatórios de grupos de répteis é fundamental para investigar várias questões relacionadas às funções do sistema cardiovascular e seus processos evolutivos em vertebrados (Taylor et al., 1999). Espécies de répteis têm sido utilizadas para estudar vários enigmas fisiológicos, tais como: o papel dos desvios cardíacos (Burggren et al., 2020; Leite et al., 2013, 2014; Eme et al., 2009; Taylor et al., 2009); o papel da inervação vascular parassimpática (Filogonio et al., 2020; Taylor et al., 2009; Leite et al., 2013, 2014); a evolução das câmaras cardíacas (Jensen et al., 2010, 2013a); a ontogenia da inervação do coração (Sartori et al., 2012, 2015); o efeito da temperatura no sistema cardiovascular (Baker et al., 1972; Galli et al., 2004; Bícego et al., 2007; Filogonio et al., 2019); ajustes de sazonalidade (Zena et al., 2016); posicionamento do coração e efeito da ortostase (Armelin et al., 2014); recuperação autonômica pós- instrumentação (Duran et al., 2020; Sanches et al., 2019); dentre outros. Apesar do grande interesse no sistema cardiovascular dos répteis, as investigações experimentais de alguns processos e mecanismos permanecem limitadas. Parte dos limites se baseiam no desenvolvimento de técnicas de instrumentação e confiabilidade das medidas in vivo, quando geradas sob instrumentação mais invasiva. Ou ainda, nos óbvios e corretos aspectos éticos que restringem o acesso à alguns mecanismos na experimentação animal. Desta forma, alguns mecanismos cardiovasculares tiveram sua descrição funcional baseada em preparações experimentais sob anestesia terminal (open chest). Este foi o caso do papel de fatores modulatórios como: óxido nítrico (Galli et al., 2005b; Skovgaard et al., 2005), catecolaminas (Galli et al., 2007) e bradicinina (Galli et al., 2005a). Apesar da ótima qualidade desses estudos, o modelo experimental usado supostamente limita as investigações que dependem de uma análise quantitativa das variáveis de interesse ou de modulações autonômicas complexas. As limitações dizem respeito ao conhecido efeito da anestesia nos parâmetros fisiológicos de repouso e nas funções autonômicas. Foi demonstrado que uma diversidade de substâncias anestésicas altera as variáveis fisiológicas, mesmo no melhor cenário experimental (Mosley et al., 2004; Taylor et al., 2009). Por exemplo, foi relatado que o isoflurano deprime o barorreflexo em roedores (Lee et al., 2002; Lee et al., 2004). O uso de óxido nitroso e halotano aumenta a atividade simpática eferente em cães (Bagshaw e Cox, 1982). Estudos com cascavéis indicaram que o uso de anestésicos pentobarbital diminui o tônus vagal e eleva a atividade simpática, gerando efeitos diretos no 67 sistema cardiovascular (Galli et al., 2005a). Alguns anestésicos, como os inalatórios, parecem ter efeitos menores. Foi observado que diferentes doses de sevoflurano (2,5% e 3,75%) não afetam a frequência cardíaca da tartaruga do deserto, Gopherus agassizii. Contudo, elas geram efeitos cardiovasculares já que diminuem as pressões: sistólica, diastólica e ventricular média (Rooney et al., 1999). Da mesma forma, foi observado que o isoflurano (3%) abole a modulação autonômica da frequência cardíaca e mantem algum efeito inibidor autonômico, mesmo algum tempo após o fim do fornecimento anestésico conforme observado em serpentes cascavéis, C. durissus (Sanches et al., 2019) e lagartos teiús, S. merianae (Duran et al., 2020). A despeito do efeito anestésico, a investigação de alguns mecanismos exige instrumentação complexa e/ou profunda e, portanto, dificilmente poderia ser aplicada em procedimentos para monitoramento in vivo. Por exemplo, uma investigação recente sobre o papel do desvio cardíaco teve dados complementares obtidos em diferentes grupos experimentais (Filogonio et al., 2016), o que impactou o número de animais utilizados e limitou a correlações de alguns parâmetros. A instrumentação intensa é um aspecto altamente limitante para a experimentação e, mesmo no melhor cenário possível, foi observado que afeta a recuperação autonômica e influencia o reestabelecimento adequado do repouso (Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Recentemente foi apresentado um modelo interessante para estudos de mecanismos cardiovasculares sob modulação autonômica, a preparação da cascavel descerebrada (C. durissus). O uso de animais descerebrados potencialmente permite o registro de vários parâmetros concomitantes (como variáveis ventilatórias e cardiovasculares, temperatura, atividade nervosa, etc.), uma vez que a preparação está eutanasiada, sem o córtex cerebral e tálamo. Neste preparo, o sistema nervoso autônomo (SNA) é preservado, assim como todas as funções fisiológicas controladas por ele. Tal abordagem desabilita fundamentalmente qualquer processo com integração central superior assim como, processos levem à percepção de dor e/ou qualquer possível forma/interpretação de consciência. Na verdade, por este fato, por ser um procedimento final irrecuperável, que mantem apenas as funções vegetativas, é que o processo é considerado o momento da eutanásia (Silverman et al., 2005; Castro et al., 2021; Rocha et al., 2021). Após o procedimento neste tipo de preparação, a coleta de dados pode continuar em cursos de tempo variável, que estão relacionados ao tempo de viabilidade da preparação (Silverman et al., 2005; Dobson e Harris, 2012; Woods, 1964). Assim, investigamos a viabilidade da cascavel descerebrada ao longo do tempo, o que é fundamental 68 para atestar a viabilidade do modelo e compreende a abrangência de seu uso. Para tal, avaliamos como o processo de descerebração afeta a dinâmica de recuperação/inviabilidade da preparação após a descerebração. Assim, analisamos: a manutenção das variáveis cardiovasculares em repouso; presença e magnitude de um reflexo cardiovascular modulado pelo SNA, o barorreflexo; e a presença e progressão de alterações na variabilidade da frequência cardíaca (VFC). A VFC é o resultado final da presença de múltiplos processos autonômicos sobre a frequência cardíaca e assim, sua presença e o nível de variabilidade total tem sido um indicador valioso da modulação do SNA (Task Force, 1996; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). 2. Material e métodos 2.1 Animais experimentais As cascavéis Sul Americanas, Crotalus durissus, utilizadas no experimento (n = 8, massa corporal: 852,0 ± 43,41g, média ± EPM) foram doadas pelo Instituto Butantan e mantidas no Departamento de Ciências Fisiológicas, UFSCar. Os animais eram mantidos em compartimentos individuais, em sala climatizada, com temperatura controlada à 28ºC, fotoperíodo 12:12; com água ad libitum e alimentação com roedores a cada 15 dias. A alimentação era interrompida 15 dias antes de cada experimento. Todos os procedimentos foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética (CEUA- UFSCar). 2.2 Descerebração e registro de ECG O protocolo de registro possui duas fases de instrumentação. Nesta primeira fase, foram realizados os procedimentos de descerebração e implantação de eletrodos de ECG. Utilizamos o procedimento de descerebração previamente descrito por Rocha e colaboradores (2021). Em resumo, para os procedimentos cirúrgicos, os animais foram inicialmente sedados com aumento de PCO2 (Wang et al., 1993; Leite et al., 2013, 2014) até que perdessem o controle motor. Isso permitiu manuseio seguro e intubação endotraqueal para ventilação mecânica com 3-5% de anestésico inalatório isoflurano (5 min a 5% para indução e 3% para manutenção da anestesia), 3-5 respirações × min-1 (volume corrente de 69 30 ml × kg-1). Sob anestesia, realizamos uma incisão rostro-caudal (~ 0,5cm) no dorso da cabeça para expor o crânio. Uma pequena abertura medial (~ 2-3 mm) foi perfurada na posição da 6ª escama caudal à cavidade ocular, o que permitiu acesso às meninges logo acima do teto óptico. A artéria subjacente e qualquer eventual vaso colateral foram cuidadosamente cauterizados e as meninges suavemente puncionadas e abertas. Todo o sistema nervoso, rostral a esse ponto, foi cauterizado e removido. A cavidade remanescente foi preenchida com algodão estéril para estabilização do tecido nervoso. Todas as estruturas neurais do cerebelo, tronco encefálico e porção posterior do hipotálamo permaneceram intactas. A incisão na cabeça foi posteriormente suturada. Imagens do procedimento podem ser visualizadas na Figura 1. A descerebração, como procedimento irreversível que proporciona um estado irrecuperável, é considerada o momento da eutanásia (Silverman et al., 2005; Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021) e assim, o estudo das funções autonômicas é executado em uma preparação eutanasiada com tempo de duração finito, mas ainda não conhecido. Todas as diretrizes éticas para a instrumentação animal continuaram sendo respeitadas enquanto a preparação estava em uso. Durante o mesmo plano anestésico usado para descerebração, foram implantados eletrodos para registro do eletrocardiograma (ECG). Os eletrodos foram implantados bilateralmente em posições ventrais imediatamente anterior e posterior ao coração. Um eletrodo de referência foi posicionado dorsalmente, aproximadamente 10 cm caudal aos demais. Eletrodos e fios foram suturados no dorso da preparação para garantir a estabilidade do sinal. Inicialmente, a análise qualitativa do sinal de ECG foi usada para observar e atestar a viabilidade da preparação durante a progressão do procedimento de descerebração. Após observar evidências claras de ventilação espontânea após cessado o fornecimento anestésico, cada preparação foi transferida para um compartimento experimental individual (25 x 35 x 10 cm) posicionado em uma câmara com temperatura controlada estável, à 30oC temperatura preferencial de cascavéis (Filogonio et al., 2016) onde permaneceram durante o protocolo de registro. O ECG foi registrado diariamente para possibilitar as avaliações do progresso de alteração da VFC após o processo de descerebração. Cada preparação também recebeu tratamento profilático pós-operatório com injeções de antibiótico (Enrofloxaxina 11mg·kg- 1) e anti-inflamatório (Flunixina meglumina 1,1 mg·kg-1) no momento do procedimento e 70 após 48h, assim como 10 ml de solução fisiológica (NaCl 0,9%) via injeção intraperitoneal para manutenção da hidratação. 2.3 Anatomia e histologia Registros de imagens ao longo do processo foram utilizadas para estudo do procedimento e análise das estruturas remanescentes do SNC. Assim, imagens de fases do procedimento foram registradas com lupa Zeiss (Carl Zeiss Stemi 2000c). Após o final do experimento, as preparações foram dissecadas e amostras do Sistema Nervoso Central (SNC) foram lavadas com solução salina (NaCl 0,9%) e registradas com lupa Zeiss (Carl Zeiss Stemi 2000c) por meio de câmera acoplada (AxioCam ERc 5s) com software AxioVision Rl. 4.8. Para caracterização anatômica, os tecidos foram fixados em formalina tamponada a 4%, desidratados em série crescente de álcool e incluídos em parafina. As seções (6 μm de espessura) foram coradas com o kit Tricrômio de Masson (EasyPath, EP ‐ 11‐20013, Brasil) e as fotografias foram obtidas com microscópio óptico Olympus BX61 (Olympus, Dinamarca) equipado com uma câmera conectada a um computador utilizando o software Olympus Visiopharm Integrator System -newCAST. Para referência estrutural, utilizamos imagens do SNC de duas cascavéis não descerebradas. Esses animais (Massa media = 898,75 ± 264,75g) passaram pelo mesmo procedimento de dissecção do SNC, registro e descrição. 2.4 Variáveis cardiovasculares A análise da VFC foi utilizada como bioindicador de modulação autonômica primário (Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Após observação de recuperação da VFC total, foi realizada uma segunda instrumentação para monitoramento cardiovascular. Para reduzir possíveis efeitos anestésicos sobre o sistema nervoso autônomo (SNA), após a cirurgia, o protocolo de anestesia inalatória foi aplicado com o anestésico inalável isoflurano com ventilação mecânica similar ao descrito anteriormente. Neste processo, para 71 estabilidade do animal durante o procedimento cirúrgico, foi utilizado bloqueador neuromuscular (Brometo de pancurônio - 0,5 mg·kg-1). Após indução anestésica, fizemos uma incisão ventrolateral (~ 4,5 cm) do lado direito rostral ao coração, para expor a vasculatura central. A canulação oclusiva da artéria vertebral (PE50) e de um ramo da artéria pulmonar (PE20) proporcionaram acessos ao arco aórtico direito e à artéria pulmonar, respectivamente. Isso permitiu o registro da pressão arterial sistêmica e pulmonar e cálculo da pressão arterial sistêmica média (PAMsis) e pulmonar média (PAMpul). Os cateteres foram preenchidos com solução salina heparinizada (50 UI/ml, NaCl 0,9%). Além disso, sondas de fluxo perivascular foram implantadas sobre o arco aórtico esquerdo e artéria pulmonar, para registrar os fluxos sanguíneos do arco aórtico esquerdo e do circuito pulmonar, respectivamente (?̇?Lao e ?̇?pul, 1,5PR - 1,5PR, Transonic Systems). As sondas foram envolvidas com gel de ultrassom estéril para estabilizar a transmissão do sinal. Os cabos destas foram fixados na borda da incisão ventrolateral para estabilidade da posição. Ao final do procedimento, cânulas e sondas foram fixadas com suturas no dorso da preparação. Após a instrumentação, cada preparação foi posicionada em decúbito ventral, e a anestesia cessada até o restabelecimento da ventilação espontânea. 2.5 Protocolo experimental e análise de dados As presença e nível da VFC total foi utilizada para observar e atestar a presença de modulação autonômica na preparação descerebrada. Sua análise ao longo do tempo, após a descerebração, foi utilizada para avaliar a recuperação pós-cirúrgica e estabilização da modulação autonômica de acordo com a metodologia utilizada em squamatos (Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Os registros de ECG foram utilizados para obter séries temporais de intervalos cardíacos sucessivos (RRi). As séries de RRi foram utilizadas para análises da VFC nos domínios do tempo e da frequência (software CardioSeries v2.7 - http://www.danielpenteado.com – Zena et al., 2016; Troiano et al., 2018). Análises no domínio do tempo foram utilizadas para obter o desvio padrão de RRi (SDNN) e pela raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre RRi adjacentes (RMSSD). A análise no domínio da frequência foi usada para obter o valor da variabilidade total, representada pela densidade espectral (PSD – power spectral density) usando a 72 Transformada rápida de Fourier (256 eventos consecutivos) com sobreposição de 50% após interpolação de 2 Hz (Sanches et al., 2019). Após observação de estabilidade na VFC, as preparações passaram por nova instrumentação para o registro das variáveis cardiovasculares e análises do barorreflexo em repouso. Os mesmos registros foram feitos com as preparações anestesiadas com isoflurano (~ 2%). O anestésico teve o objetivo de suprimir o SNA para verificar a presença de modulação autonômica nas variáveis cardiovasculares aferidas (frequência cardíaca, pressões arteriais médias sistêmica e pulmonar, fluxos sanguíneos sistêmicos e pulmonar, condutâncias vasculares sistêmica e pulmonar, débito cardíaco e volume sistólico total) no repouso, e no barorreflexo observado. Os registros das variáveis cardiovasculares foram iniciados 24 horas após a instrumentação. Para isso, os cateteres foram conectados a transdutores de pressão (Baxter Edward PX600). Estes foram calibrados contra uma coluna de mercúrio e acoplados a pré- amplificadores de sinal (Bridge Amp, ADInstruments). As sondas de fluxo foram conectadas a um medidor de fluxo sanguíneo para transdução e amplificação (Transonic Systems). O ECG foi registrado com os eletrodos previamente implantados. Os amplificadores foram conectados a um conversor A/D e continuamente registrados (1k·seg-1), Powerlab/LabChart, ADInstruments). As variáveis cardiovasculares permaneceram estáveis logo após as conexões. Bloqueador neuromuscular (Brometo de pancurônio - 0,5 mg·kg-1) foi utilizado para prevenir movimentos corpóreos eventuais. A injeção não alterou os parâmetros cardiovasculares registrados. O sinal foi registrado por 2h após esta preparação para certificar a linha de base. As pressões arteriais médias (PAM, mmHg) sistêmica e pulmonar foram calculadas como: PAM = 1/3 (Psistólica) + 2/3 (Pdiastólica). A frequência cardíaca (ƒH, bpm) foi derivado do sinal de ECG. O fluxo sanguíneo sistêmico (?̇?sis, ml·min-1·kg-1) foi calculado a partir do registro de ?̇?Lao usando fatores de correção onde ?̇?sis = 2,6·?̇?Lao (Filogonio et al., 2014) e ?̇?sis = 3,3·?̇?sis (Galli et al., 2005b) para cascavéis não anestesiadas e anestesiadas, respectivamente. O débito cardíaco (DC) foi calculado como a soma de ?̇?sis e ?̇?pul por tempo, e o volume sistólico total (pulmonar + sistêmico) foi calculado como ?̇?sis·ƒH-1 (Crossley et al., 1998; Galli et al., 2005b). As condutâncias vasculares sistêmica e pulmonar foram calculadas como G (ml·min-1·kg-1·kPa-1) = ?̇?·P-1 (Lautt, 1989; O’Leary, 73 1991). A direção do desvio foi indicada pela razão: ?̇?pul·?̇?sis -1 (Hicks e Comeau, 1994). Assim, o desvio D-E foi identificado para valores de razão <1 enquanto o desvio E-D foi identificado para valores > 1 (Hicks, 1996). Complacência vascular, C (ml·kg-1·kPa-1) foi calculado como Vsis·PP (onde, PP = pressão de pulso; Chan et al., 2005). O Método da Sequência foi utilizado para analisar a presença e atividade do barorreflexo (ƒH, PAM, Gop - ms·kPa-1, BEI, número de sequências barorreflexas e número total de rampas - Filogonio et al., 2019b). Para este, analisamos séries sequenciais de 300 ciclos cardíacos utilizando valores da pressão sistólica e RRi extraído do sinal PAMsis (LabChart - AD Instruments; software CardioSeries) de acordo com Di Rienzo e colaboradores (2001) e Filogonio e colaboradores (2019). Vinte e quatro horas após o registro dos parâmetros cardiovasculares de repouso, a preparação foi intubada para ventilação mecânica e novamente anestesiada (5% de isoflurano durante 5 minutos para indução e 2% para manutenção da anestesia). Os parâmetros cardiovasculares e do barorreflexo foram registrados e analisados sob o efeito anestesia para identificar alterações decorrentes de modulação autonômica. O barorreflexo e VFC foram utilizados como índices de regulação autonômica. Os parâmetros foram comparados entre preparações estáveis antes e após a anestesia. Após o término de todos os protocolos experimentais, cada preparação recebeu injeção intravascular de Tiopental (100 ml·kg-1 - Pearson, Brasil) seguida de solução hipersaturada de KCl. 2.6 Análise estatística Variações nos valores médios das variáveis de VFC (ƒH, RRi, PSD, RMSSD, SDNN) foram comparadas ao longo do tempo utilizando ANOVA One-Way e teste de Tukey ou teste de Kruskal-Wallis e Dunn de acordo com as distribuições de resíduos (P <0,05; n = 10; GraphPad Prism 7.0). Os valores médios para as variáveis cardiovasculares em repouso (ƒH, PAMsis, PAMpul, ?̇?sis, ?̇?pul, DC, Vstot, Gsis, Gpul e a razão ?̇?pul·?̇?sis-1) entre os grupos preparação estável e preparação anestesiada foram comparados com o teste t ou Mann- 74 Whitney após análise de distribuição (Shapiro-Wilk). O valor de P <0,05 foi considerado em todos os casos (n = 8; GraphPad Prism 7.0). Os valores médios dos parâmetros do barorreflexo (ƒH, PAM, Gop, índice de eficiência do barorreflexo BEI, número de sequências barorreflexas, número total de rampas) foram testados para distribuição gaussiana (Shapiro-Wilk) e comparados entre preparação estável e grupos anestesiados utilizando teste t, (P <0,05; n = 8; GraphPad Prism 7.0). Valores médios para variáveis cardiovasculares em repouso (fH, PAMsis, PAMpul, ?̇?sys, ?̇?pul, DC, Vstot, e a razão ?̇?pul·?̇?sys-1) de dados previamente relatados com a mesma preparação - 24h após a descerebração (Rocha et al., 2021) foram comparados com valores da preparação a longo prazo utilizando One Sample t-test (P <0,05; GraphPad Prism 7.0). 3. Resultados 3.1 Anatomia e histologia A figura 1 ilustra fases da cirurgia de descerebração destacando-se o uso do método da cauterização que minimiza problemas com a hemorragia. A aplicação do cauterizador ocorre em ponto medial no teto óptico. É esperado que o calor e pequenos pontos de sangramentos dentro do SNC possuam efeito na borda do tecido remanescente. Ao final do procedimento o tecido restante é composto pelo cerebelo e estruturas caudais, como observados na figura 3. A comparação entre o encéfalo das preparações e o de animais intacto permitiu analisar a região do córtex que é destruída no procedimento de descerebração (figura 2 e 3). 75 Figura 1. Passos do processo de descerebração em cascavel sul-americana Crotalus durissus. Sequências de imagens do dorso da cabeça de cascavel (682,54g) através de campo cirúrgico, onde observa-se: A, indicação da área de incisão (seta vermelha); B, incisão rostro-caudal medial; C, abertura do crânio com visão do vaso central; D, visão do teto óptico após cauterização do vaso e abertura das meninges; E, cavidade remanescente após cauterização e retirada do tecido nervoso; F, cavidade preenchida para estabilização. Escala 5mm. 76 Figura 2. Imagens de encéfalo de cascavel não descerebrada, Crotalus durissus (898,75 ± 264,75g). A - Imagem da superfície do SNC, vista dorsal; B - imagem da superfície do SNC, vista lateral; C - histologia do SNC, secção coronal na região medial; D - histologia do SNC, secção sagital na região medial. Linha tracejada indica área de corte no processo de descerebração. Ce - cerebelo, Hc- hemisférios cerebrais, Bu - bulbo, Bo - bulbos olfatórios, Qo - quiasma óptico, To - teto óptico, Po - ponte, Me - medula espinhal. Coloração Tricrômio de Masson. 77 Figura 3. Imagens de encéfalo de cascavel descerebrada, Crotalus durissus (682,54). - Imagem da superfície do SNC, vista dorsal; A - imagem da superfície do SNC; B - imagem da superfície do SNC, vista lateral; C - histologia do SNC, secção coronal na região medial; D - histologia do SNC, secção sagital na região medial. Seta vermelha indica uma área da seção para descerebração. Ce - cerebelo, Bu - bulbo, To - teto óptico, Po - ponte, Me - medula espinhal. Coloração Tricrômio de Masson. 3.2 Modulação autonômica após descerebração A ƒH média e VFC alteraram-se ao longo do tempo após o procedimento de descerebração. A ƒH média, que estava elevada inicialmente, diminuiu nas primeiras 24h após a cirurgia. A fH permaneceu estável em torno de aproximadamente 25bpm ao longo dos 15 dias restantes (Fig. 4). A variabilidade de frequência cardíaca total, no entanto, indexada pela densidade espectral PSD (power spectral density), permaneceu em valores muito baixos durante os 6 dias seguintes. O PSD aumentou no 7º dia e permaneceu elevado e estável até o 15º dia variando entre 1·105 e 3·105 ms2. Em paralelo à recuperação de valores mais elevados de PSD, ocorre a esperada recuperação da dispersão deste sinal (Fig. 4). O perfil de recuperação do PSD foi corroborado pelas alterações observadas no domínio do tempo, RMSSD e SDNN, que indicam recuperação no 7º dia e estabilização após este momento (Tabela 1). 78 Figura 4. Variação da frequência cardíaca média (ƒH - Painel A) e densidade espectral (PSD - Painel B) ao longo do tempo, após procedimento de descerebração em cascavéis, Crotalus durissus, a 30°C. Círculos são valores médios ± EPM. O tempo zero é a primeira hora após a cirurgia. Letras diferentes indicam médias diferentes (Kruskal-Wallis - Dunns’s, P <0,05, n = 10). Tabela 1. Parâmetros de VFC ao longo do tempo após descerebração em cascavel, C. durissus, a 30°C. Tempo após descerebração RRi (s) fH (bpm) PSD (ms2) RMSSD (ms) SDNN (s) Primeira hora 1,40 ± 0,07a 43,88 ± 2,32a 769,8 ± 297,7a 22,02 ± 6,73a 160,9 ± 120,5a 5 dias 2,16 ± 0,07ab 28,59 ± 0,96b 11.382 ± 4.914ab 47,31 ± 9,29ab 361,2 ± 232,2ab 7 dias 2,56 ± 0,18b 24,44 ± 1,60b 146.164 ± 90.882b 355,9 ± 172,1b 495,4 ± 183,6b 10 dias 2,70 ± 0,16b 23,23 ± 2,06b 225.135 ± 72.838b 410,6 ± 127,8b 635,2 ± 236,8b 15 dias 2,77 ± 0,28b 23,92 ± 3,88b 186.834 ± 108.520b 368,2 ± 151,1b 722,6 ± 333,8b Análises de VFC (valores são médias ± EPM): RRi – intervalo de tempo entre batimentos cardíacos; ƒH - frequência cardíaca; PSD - densidade espectral; RMSSD - Raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre intervalos NN adjacentes; SDNN - Desvio padrão de todos os intervalos NN. Letras diferentes denotam valores diferentes ao longo do tempo. (ANOVA One-Way - Tukey / Kruskal-Wallis - Dunns’s; P <0,05; n = 10). 3.3 Parâmetros cardiovasculares em repouso em animais descerebrados Os valores médios das variáveis cardiovasculares medidas nas preparações descerebradas não anestesiados em repouso são apresentados na Tabela 2. Os valores de ?̇?sys e ?̇?pul na preparação de longo prazo foram menores e maiores, respectivamente, que os valores registrados 24h após descerebração para animais não anestesiados e, 79 consequentemente, a direção do desvio intracardíaco foi diferente entre esses dois grupos (Tabela 4). Da mesma forma, a comparação com dados publicados anteriormente de serpentes em repouso não anestesiadas, em geral, indicou que as variáveis cardiovasculares foram semelhantes ao que foi relatado para animais em repouso (Tabela 4). Tabela 2. Parâmetros cardiovasculares de preparações de cascavel (Crotalus durissus), descerebradas estáveis, a 25°C, com e sem anestesia inalatória (2% de isoflurano) e 24h após descerebração. Parâmetros cardiovasculares Sem anestesia (15 dias) 2% Iso (15 dias) Rocha et al. (2021) Sem anestesia (24h) PAMsis (kPa) 5,02 ± 0,39 3,46 ± 0,58* 4,50 ± 0,27 ?̇?sis (ml·min-1·kg-1) 18,82 ± 2,96 22,62 ± 8,16 29,80  1,3† Gsis (ml·min-1·kg-1·kPa-1) 5,46 ± 0,99 4,94 ± 0,85 - PAMpul (kPa) 2,73 ± 0,29 2,66 ± 0,22 3,21 ± 0,33 ?̇?pul (ml·min-1·kg-1) 17,04 ± 2,99 20,78 ± 3,62 7,10  1,0† Gpul (ml·min-1·kg-1·kPa-1) 6,69 ± 1,33 8,71 ± 1,91 - Vstot (ml·kg-1) 1,00 ± 0,14 1,27 ± 0,25 1,00 ± 0,22 fH (beats·min-1) 35,1 ± 2,02 33,89 ± 2,84 36,60  0,7 DC (ml·min-1·kg-1) 34,23 ± 5,90 43,47 ± 9,65 36,90  1,2 ?̇?pul · ?̇?sis-1 1,16 ± 0,28 1,29 ± 0,24 0,24  0,09† Os valores são médias ± EPM: PAMsis - pressão arterial média sistêmica; ?̇?sys - fluxo sistêmico; Gsys - condutância sistêmica; PAMpul - pressão arterial média pulmonar; ?̇?pul - fluxo pulmonar; Gpul - condutância pulmonar; ƒH - frequência cardíaca; Vstot - volume sistólico total; DC - débito cardíaco e ?̇?pul · ?̇?sys-1 - direção do shunt, * indica diferenças entre preparações descerebradas anestesiadas e não anestesiadas (teste t / Mann-Whitney; P <0,05; n = 8); indica † diferenças entre os grupos de preparação descerebrados não anestesiados de Rocha e colaboradores (2021), e o presente trabalho (t-test uma amostra; P < 0,05). 80 3.4 Modulação cardiovascular autonômica oferece suporte ao barorreflexo Os animais descerebrados apresentaram clara atividade barorreflexa (Tabela 3). A preparação apresentava oscilações de pressão arterial normal, observadas como número de rampas de pressão. Parte delas foi seguida por oscilações compensatórias da frequência cardíaca, configurando sequências barorreflexas à uma proporção similar ao animal não descerebrado (rampas, sequencias e BEI – Tabela 3). A preparação manteve a PAM estável por possuir um ganho compensatório médio (Gop) similar ao de um animal não descerebrado (Tabela 3). Tabela 3. Barorreflexo em grupos experimentais de cascavéis descerebradas, Crotalus durissus: preparação estável e preparação anestesiada (2% de isoflurano). Parâmetros Barorreflexos Sem anestesia 2% Iso fH (beats·min-1) 34,19 ± 1,54 35,46 ± 2,47 PAM (kPa) 5,62 ± 0,41 3,68 ± 0,64* C (ml·kg-1·kPa-1) 0,81 ± 0,16 1,69 ± 0,34* Gop (ms·kPa-1) 1.130,0 ± 229,7 1.230 ± 263,4 BEI 0,21 ± 0,02 0,21 ± 0,03 Número de sequências barorreflexas 16,00 ± 2,05 13,88 ± 1,55 Número total de rampas 74,75 ± 2,13 73,00 ± 5,45 Os valores são médias ± EPM: frequência cardíaca (ƒH), pressão arterial média (PAM), complacência vascular (C), ganho operacional do barorreflexo (Gop), índice de eficiência do barorreflexo (BEI), número de sequências barorreflexas, número total de rampas. * denota diferenças entre os grupos de preparação de descerebrados anestesiados e não anestesiados (teste t; P <0,05; n = 8). 3.5 O efeito da anestesia sobre os parâmetros cardiovasculares O nível de anestesia utilizado não causou grandes alterações nas variáveis cardiovasculares. A única variável fortemente afetada pelo protocolo anestésico utilizado (2% - Iso) foi a pressão arterial sistêmica (Tabela 2). 81 Após a primeira cirurgia, a presença de anestesia manteve os valores de VFC, RMSSD, SDNN e RRi atenuados até o 7º dia de recuperação, A influência da ƒH ocorreu apenas 24 horas após o procedimento (Tabela 1). As preparações anestesiadas apresentaram VFC extremamente baixas com um PSD médio de 39,90 ± 30,81. Os valores da PAM foram atenuados sob anestesia, no entanto, os valores médios de Gop, ƒH, BEI, número de sequências barorreflexas e número total de rampas não foram diferentes. Isso está de acordo com a maior condutância e complacência vascular observada naquele grupo (Tabela 3). Os parâmetros cardiovasculares de Crotalus durissus intactas com e sem a presença de anestésicos, relatados na literatura estão inseridos na tabela 4. 82 Tabela 4. Parâmetros cardiovasculares de estudos prévios em cascavel (Crotalus durissus), com e sem anestesia. Parâmetros cardiovasculares Não-anestesiado anestesiado Tavares et al., (present work) Rocha et al., (2021) Taylor et al. (2009) Filogonio et al. (2016) Sanches et al., (2019) Filogonio et al. (2019) – Media±SD Tavares et al., (present work) Rocha et al., (2021) Galli et al. (2005a) Galli et al. (2005b) Skals et al. (2005) Galli et al. (2007) Sanches et al., (2019) PSD (ms2) 186.834 ± 108.520 - - - 197.044 ± 111.242 39,90 ± 30,81 - - - - - 900 ± 101 RMSSD (ms) 368,2 ± 151,1 - 270,4 ± 126,84 18,30 ± 15,12 - 8,42±2,18 Gop (ms·kPa-1) 1.013,1 ± 231,1 - - - - 2.811,9 ± 1.599,7 2,268 ± 429,8 - - - - - - PAMsis (kPa) 5,02 ± 0,39 4,50 ± 0,27 - 4,4 ± 0,15 - - 3,46 ± 0,58 2,93 ± 0,23 4,1 ± 0,7 - 4,4 ± 0,4 2,7 ± 0,3 - ?̇?sis (ml·min-1·kg-1) 18,82 ± 2,96 29,80  1,3a 24,1 ± 2,8 - - - 22,62 ± 8,16 24,8 ± 2 95,2 ± 19,0 31,1 ± 2,6 128,2 ± 41,2 46,1 ± 6,9 - Gsis (ml·min-1·kg-1·kPa-1) 5,46 ± 0,99 - - - - - 4,94 ± 0,85 - 23,5 ± 5,2 - - 18,4 ± 3,7 - PAMpul (kPa) 2,73 ± 0,29 3,21 ± 0,33 - 2,3 ± 0,6 - - 2,66 ± 0,22 2,33 ± 0,37 3,1 ± 0,1 - - 2,4 ± 0,2 - ?̇?pul (ml·min-1·kg-1) 17,04 ± 2,99 7,10  1,0 a 33,6 ± 4,2 - - - 20,78 ± 3,62 7,6 ± 0,6 b 56,3 ± 13,5 - 63,8 ± 20,1 24,6 ± 6,1 - Gpul (ml·min-1·kg-1·kPa-1) 6,69 ± 1,33 - - - - - 8,71 ± 1,91 - 19,6 ± 5,9 - - 11,2 ± 3,0 - Vstot (ml·kg-1) 1,00 ± 0,14 1,00 ± 0,22 2,35 ± 0,30 1,3 ± 0,1 - - 1,27 ± 0,25 0,99 ± 0,22 - - 3,7 ± 0,7 1,4 ± 0,3 - fH (beats·min-1) 35,1 ± 2,02 36,60  0,7 28,2 ± 2,4 - 29,97 ± 6,0 - 33,89 ± 2,84 32,50  1,0 43,4 ± 4,2 - 50,9 ± 2,8 45,1 ± 3,0 39,9 ± 1,5 DC (ml·min-1·kg-1) 34,23 ± 5,90 36,90  1,2 - - - - 43,47 ± 9,65 32,4 ± 1 - - - - - ?̇?pul · ?̇?sis-1 1,16 ± 0,28 0,24  0,09 a 1,20 ± 0,14 - - - 1,29 ± 0,24 0,31 ± 0,12 b - - 2,6 ± 0,8 0,6 ± 0,1 - Os valores são médias ± SEM. PSD - densidade espectral de potência, PAMsis - pressão arterial média sistêmica; Q ̇sis - fluxo sistêmico; Gsis - condutância sistêmica; PAMpul - pressão arterial média pulmonar; Q ̇pul - fluxo pulmonar; Gpul - condutância pulmonar; Vstot - curso total; ƒH - volume da frequência cardíaca; DC - débito cardíaco e Q ̇pul · Q ̇sis-1 - direção do shunt. a denota diferenças entre os grupos de preparação descerebrados não anestesiados de Rocha et al. e o presente trabalho; b denota diferenças entre os grupos de preparação descerebrados anestesiados de Rocha et al. e o presente trabalho (teste t de uma amostra; P <0,05). 83 4. Discussão Preparação descerebrada O método usado para descerebração foi baseado em estudos anteriores (Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021). Com base nos presentes dados, observamos que a preparação permanece estável ao longo de, ao menos, 15 dias após o procedimento preparatório. Ela é capaz de recuperar a capacidade da modulação autonômica e manter os parâmetros cardiovasculares no nível de repouso. Da mesma forma, não foi observado perda ou decréscimo de função modulatória autonômica para a manutenção da pressão arterial e para os processos que resultam na VFC até o final deste período. O uso de preparações descerebradas é comum em vertebrados e tem sido descrito para várias espécies como ratos, gatos, coelhos, peixes e sapos em diferentes finalidades (Faber et al., 1982; Pickering e Paton, 1996; Uematsu e Todo., 1997; Wang et al., 1999). Essa abordagem experimental é necessária quando questões relevantes não podem ser tratadas adequadamente por experimentos in vivo. Especificamente, a descerebração envolve estudos do controle ou monitoramento de função profunda específica (por exemplo, função cerebral, reflexos posturais, nocicepção, ventilação, ingestão – Pickering e Paton, 1996; Hayashi, 2003; Darling e Ritter, 2009; Matsukawa, 2016), ou envolvem instrumentação profunda para investigar questões mecanísticas que não dependem da interação animal x ambiente (por exemplo, registro de atividade nervosa relacionada às interações cardiorrespiratórias – Barrett e Taylor, 1985; Wang et al., 1999). Observamos que o termo descerebração pode descrever procedimento bem diferentes. Ele já foi utilizado para nomear procedimentos de ablação de parte diferentes do SNC como a remoção de hemisférios cerebrais (Fedde et al., 1977), ou de todo o telencéfalo (Stehouwer, 1987; Uematsu e Todo, 1997). Ele foi utilizado para descrever parte do procedimento para registro de tecido nervoso in situ, no tronco cerebral isolado, ou registro in vitro de fatias nervosas e/ou outra preparação segmentada (Barrett e Taylor, 1985; Funk e Greer, 2013; Moraes et al., 2014). Tais procedimentos são descritos atualmente como registros ex vivo ou in vitro. Atualmente, apesar de variações no procedimento, de forma geral, o método consiste minimamente na inativação do córtex tálamo, e o sistema límbico (Mosley, 2011; Perry e Nevarez, 2018) em um processo irreversível de perda de função do SNC que é, portanto, identificado como o momento da eutanásia (Silverman et al., 2005; Rocha et al, 2021; Castro et al., 2021). 84 O encéfalo de cascavéis possui formato alongado e com macroestrutura bem definidas e similares a outros squamatos, o que possibilitou sua identificação (fig. 3). Embora não haja referência na literatura para a descrição anatômica e histológica desta espécie, utilizamos a referência anatômica de outras serpentes e outros répteis (Warner, 1945; Allemand et al., 2007; Naumann et al., 2015) para escolha do nível de secção e do tecido a ser inviabilizado, como pode ser visto nas figuras 3 e 4. O nível de secção pode ser diferente a depender das características da espécie e da função a ser estudada. A descerebração pode ainda envolver inviabilização de tecido nervoso por aspiração do mesmo, secção, cauterização ou lesão química (Dobson e Harris, 2012; Stehouwer, 1987). O uso da cauterização foi interessante neste caso, pois um dos desafios do procedimento foi impedir casos de sangramentos ao longo do processo. O sangramento pode causar problemas por diversos motivos. Uma hemorragia grave pode causar problemas pela perda de sangue em si. Ela pode causar isquemia no tecido nervoso pela inviabilização dos vasos lesionados e não ocluídos, ou por gerar coágulos nos vasos atingidos. Casos de hemorragia no tecido nervoso, em especial, podem ocasionar a formação de coágulos no tecido remanescente, inviabilizando sinapses e assim, prejudicando vias de transmissão nervosas e ou centros funcionais (Woolf, 1984; Tankovic-Capin et al., 1998). A cauterização, apesar de causar dano físico ao tecido imediatamente adjacente à secção reduziu sangramentos ao mínimo, eliminando uma das principais limitações do procedimento. Por este ser o momento da eutanásia, uma preparação descerebrada, após o procedimento, estará progredindo à inviabilização funcional. A retirada de parte do SNC invariavelmente, causará perda progressiva de funções que, eventualmente, resultarão em sua inutilização. A duração da viabilidade da preparação é um dos principais desafios para esta abordagem experimental (Clarke e Harris, 2001; Marchenko et al., 2002; Smith et al., 2002; Silverman et al., 2005; Dobson e Harrss, 2012). Normalmente, uma preparação descerebrada mantém apenas parte das funções do animal e, portanto, só é viável por um curto período de tempo – geralmente minutos ou horas (por exemplo, Wang et al., 1999; Reid et al., 2003; Wang et al., 2004; Zoccal et al., 2018). De fato, espera-se que o decréscimo progressivo na estabilidade da preparação comece no momento em que sua integridade fisiológica é prejudicada e esse é um dos principais motivos das limitações de protocolos experimentais. Portanto, um bom modelo experimental deve ser validado tanto para o nível/magnitude das variáveis de interesse e capacidade de respostas funcionais, quanto para sua estabilidade ao longo do tempo. Também argumentamos que validar o nível adequado 85 de modulação autonômica deve ser um ponto de interesse durante o desenvolvimento da preparação e da técnica, embora tal aspecto seja geralmente negligenciado. Nosso preparo crônico manteve uma faixa de parâmetros cardiovasculares em repouso ao longo de 15 dias, apresentando valores de variáveis cardiovasculares semelhantes aos observados por Rocha et al., (2021), 24 horas após a cirurgia. Embora tenhamos observado diferenças nos valores de fluxo sanguíneo, os demais valores cardiovasculares foram semelhantes ao que tem sido relatado na literatura para cascavéis acordadas (Taylor et al., 2009; Filogonio et al, 2016; Filogonio et al., 2019; Sanches et al., 2019). Apesar de tal semelhança, verificamos que apenas 2 dos 6 estudos (nos referimos apenas a artigos que apresentaram valores tabelados), foram realizados com cascavel recuperada/não anestesiada (Galli et al., 2005a; Galli et al., 2005b; Skals et al., 2005; Galli et al., 2007; Taylor et al., 2009; Filogonio et al., 2016). Além disso, nossa preparação também manteve a modulação autonômica sem mostrar sinais detectáveis de deterioração da função. Sugerimos que tal resultado interessante foi a combinação oportuna entre a técnicas de descerebração utilizadas, que foi capaz de manter processos autonômicos importantes; com o baixo custo metabólico, característico da espécie escolhida. Essa combinação resultou em uma preparação estável e responsiva com longa duração. O tempo de duração de uma preparação descerebrada varia muito. Alguns estudos que avaliaram parâmetros cardiovasculares ou comportamentais em mamíferos realizaram a coleta de dados entre 15 minutos (Ghali, 2019) a 2 horas após a cirurgia (McMahon e McWilliam, 1922; Montano et al., 1992). Este tempo pode ser estendido até 15 dias de recuperação (ratos - Grigson et al., 1997). Woods (1964) avaliou cronicamente as respostas comportamentais em 36 ratos descerebrados, com nove animais permanecendo viáveis por até 98 dias. Os autores relataram que a alimentação e a manutenção da temperatura foram os principais problemas identificados para a integridade da preparação, embora os principais reflexos permanecessem inalterados. Questões como manutenção da temperatura corporal e alimentação frequente não são problemas para cascavéis como animais ectotérmicos com comportamento alimentar senta e espera (Leite et al., 2014; Whitford et al., 2019). No entanto, usamos injeção i.p. de solução salina para garantir hidratação adequada. Portanto, fomos capazes de estender a esperada deterioração da preparação ao longo do tempo. A perda de função não foi detectada pelas variáveis cardiovasculares registradas ao longo dos 15 dias de monitoramento. Isso valida tal preparação para protocolos 86 experimentais mais longos e assim, abre oportunidades para diversas abordagens investigativas. Estudos que se limitam a animais acordados, como os ajustes cardiovasculares progressivos para suportar alta demanda metabólica, como alteração de temperatura, incremento metabólico pós-prandial, limitação de suporte relacionada à alteração ambiental, como aquecimento ou estudos sobre as vias de nocicepção, e sobre a interferência farmacológica crônica são exemplos do possível uso do modelo do animal descerebrado. Recuperação de VFC Analisamos a presença e a magnitude de variáveis da VFC como índices de recuperação da modulação autonômica. A VFC é o resultado final de múltiplos processos e reflexos modulatórios autonômicos sobre a frequência cardíaca instantânea (Task Force, 1996). A VFC tem sido utilizada para apontar a recuperação autonômica em répteis (Campbell et al., 2006; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Nestes casos, a densidade do espectro da variabilidade cardíaca no domínio da frequência foi usada como indicador de VFC total e utilizado para análise quantitativa do procedimento de recuperação. Embora o coração de vertebrados seja miogênico, a ƒH instantânea é controlada pelo sistema nervoso autônomo (Task Force, 1996; Wang et al., 1999). A modulação parassimpática é predominante para esses ajustes finos entre batimentos (Taylor et al., 2014) e é responsável pela maior parte da VFC em todos os vertebrados estudados até o momento. Nos grupos não mamíferos ela gera quase que a totalidade da VFC (Taylor et al., 2014; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). A arritmia sinusal respiratória, como uma variabilidade modulatória parassimpática, só é observada em ectotermos em repouso. O adequado equilíbrio entre SNA simpático e parassimpático favorecendo a modulação colinérgica é necessário para isso (Monteiro et al., 2018; Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). Portanto, o PSD, cujo valor foi de 186,834 ± 108,520, se manteve estável após o 7º dia até o fim dos registros, isto indica que há o restabelecimento da modulação autonômica sobre o coração e também, que há equilíbrio entre as modulações parassimpática e simpática semelhante ao equilíbrio de repouso das serpentes intactas. Estas possuem PSD médio em torno de 197,044 ± 111,242 ms2, valor muito similar ao observado no presente trabalho (Sanches et al., 2019). 87 A ƒH média foi recuperada e manteve-se estável a partir de 24 horas após a descerebração. O PSD, contudo, demorou 7 dias para o mesmo. A discrepância entre a recuperação do PSD e da ƒH média já foi relatada recentemente em répteis (Sanches et al., 2019; Duran et al., 2020). A ƒH média e PSD se recuperaram em momentos diferentes em lagartos teiú (Duran et al., 2020) e cascavéis (Sanches et al., 2019) após instrumentação invasiva para implantação de dispositivo de telemetria. Nesses experimentos, o PSD levou dias para se recuperar e estabilizar, enquanto o ƒH média voltou aos valores basais estáveis após 24h. Ambos parâmetros foram recuperados juntos em curto período de tempo após instrumentações simples, com implantação de eletrodos de ECG em peixes pulmonados (Monteiro et al., 2018). Assim, o tempo de recuperação destas variáveis pode estar relacionado ao quão invasivo é o procedimento indicando que procedimentos mais profundos teriam efeitos mais longos sobre a modulação autonômica (Monteiro et al., 2018; Duran et al., 2020). É importante considerar que aspectos como dor, desconforto, alerta, assim como as condições de acomodação experimental podem alterar a modulação autonômica e influenciar a recuperação do PSD. A fH média, contudo, está relacionada diretamente ao debito cardíaco e assim, a taxa metabólica média do animal. Desta forma, em condições minimamente estáveis, deve retornar à níveis basais junto com o metabolismo. Uma mesma fH média pode ser desenvolvida sob diferentes níveis de tônus autonômico, enquanto a VFC variará em níveis de equilíbrio distintos. A modulação autonômica para VFC (afirmada pela recuperação do PSD) depende de uma interação autonômica fina, que inclui ajustes gerados por muitas interações centrais e reflexos periféricos e tal equilíbrio é, provavelmente, mais difícil de ser recuperado após mudanças. É interessante que o processo de descerebração não prejudique a recuperação do PSD e das demais variáveis que indicam a VFC total (RMSSD, SDNN e RRi). Esse fato indica que, apesar de ser afetada pelo input central, a modulação autonômica para VFC não é dependente da modulação central sobre o sistema autonômico em animais em repouso. Além disso, este resultado indica que a preparação utilizada é capaz de recobrar e refinar sua modulação autonômica quando devidamente recuperada. Ajustes barorreflexo O barorreflexo está presente e trabalhando em um nível observado no repouso em cascavéis acordadas. A análise do barorreflexo foi realizada pelo método da sequência, uma vez que permite adquirir dados sem o uso de drogas (Filogonio et al., 2019b). Além disso, o 88 método de sequência permite a avaliação de mudanças espontâneas na pressão arterial de forma que é possível caracterizar essas respostas sob comportamentos espontâneos e sem a necessidade de intervenções potencialmente estressantes no animal (Filogonio et al., 2019b; Di Rienzo et al., 2001). Com o método de sequência, recentemente, o Gop foi registrado em algumas espécies de squamatos. Sua média e desvio padrão em cascavel, iguana verde e lagarto teiú foram de 2.811,9 ± 1.599,7, 642,2 ± 306,8 e 2.210,2 ± 2.084,2, respectivamente (Filogonio et al., 2019b). Estes valores foram relativamente semelhantes aos encontrados na preparação descerebrada, 1.013,1 ± 653,5. O BEI varia próximo à 0,3 em vertebrados (Di Rienzo, 2001; Filogonio et al., 2019). O valor do BEI na cascavel descerebrada foi próximo a este, 0,21, e parece ser semelhante aos valores apresentados por Filogonio e colaboradores (0,20 – Filogonio et al., 2019). Este valor indica que, em cerca de 20% dos casos, o barorreflexo é capaz de superar as demais modulações concomitantes e pode recrutar ajustes. O número de rampas do barorreflexo, que indicaria a atividade do barorreflexo frente à oscilação natural do sinal da pressão arterial, também é semelhante ao da cascavel intacta (Filogonio et al., 2019). O barorreflexo é complexo e envolve ajustes cardíacos (analisados pelo barorreflexo) e vasculares. Como ambos os ramos do barorreflexo são necessários para a manutenção da pressão arterial, podemos indicar com segurança que o SNA tem ampla capacidade de modulação do sistema cardiovascular na preparação descerebrada. Assim, como estavam sob modulação adequada, os valores da pressão arterial e da frequência cardíaca permaneceram constantes ao longo da duração do protocolo. Os efeitos da anestesia A alternativa inicial viável para enfrentar tais problemas de recuperação de instrumentação seria o uso de animais anestesiados para aquisição de dados. No entanto, tal abordagem pode enviesar os resultados. A anestesia acarreta alteração autonômica que, por sua vez, modifica as funções cardiovasculares e prejudica a coordenação das respostas. Por exemplo, foi relatado que a anestesia com isoflurano e enflurano atenuam as respostas cardiovasculares, PAM ou ƒH (Lee et al, 2002; Lee et al., 2004; Mosley et al., 2004). O uso 89 da presente preparação descerebrada revelou novos aspectos da modulação cardiovascular, especialmente no que diz respeito à modulação do circuito pulmonar (Castro et al., 2021) que não foram detectados pelos animais anestesiados (Galli et al., 2005b; Galli et al., 2007). Como o anestésico causa depressão do SNA, ele pode afetar as respostas reflexas de controle de ƒH e PAM médias. Estudando cães, Seagard e colaboradores (1983) avaliaram as respostas nos níveis do arco barorreflexo sob efeito do isoflurano e afirmaram que a ação anestésica afeta as vias nervosas aferentes e eferentes, o SNC, os gânglios periféricos e o próprio coração. Isoflurano e enflurano induziram depressão do barorreflexo em ratos, diminuindo a PAM e ƒH (Lee et al, 2002; Lee et al., 2004). Embora o isoflurano venha sendo utilizado atualmente em répteis, ainda não temos informações detalhadas sobre seus efeitos em diferentes grupos de répteis. A preparação descerebrada anestesiada apresentou atenuação nos valores de PAM induzida pelo isoflurano, porém nenhuma alteração na ƒH, conforme demonstrado por Rooney et al., (1999) em tartarugas do deserto (Gopherus agassizii) submetidas a sevoflurano. Jakobsen e colaboradores (2017) observaram aumento de ƒH em Phython regius submetidas a três regimes diferentes de isoflurano, mas nenhuma alteração significativa nos valores de PAM. Em iguanas verdes, foi observado que maiores concentrações de isoflurano também diminuem a PAM e aumentam a ƒH (Mosley et al., 2004). Segundo esses autores, os efeitos anestésicos podem ser específicos para cada espécie. Essa seria uma possível explicação para o resultado do Gop maior que do o esperado nos animais anestesiados, visto que em outros estudos o anestésico normalmente suprimia o barorreflexo (Lee et al, 2002; Lee et al., 2004). O ganho barorreflexo não foi reduzido sob anestesia e este é um resultado que deve ser interpretado com cautela. Não se espera que a anestesia mantenha inalterada qualquer modulação de base neural. Em primeiro lugar, esse resultado indica que o ramo cardíaco do barorreflexo estava ativo. Indica também que foi menos afetado pelo nível de anestésico utilizado (2%), conforme evidenciado anteriormente pela manutenção da ƒH média. Portanto, em cascavéis, baixos níveis de anestesia com isoflurano, manteriam parte das modulações cardíacas, ao mesmo tempo em que afetariam o controle autonômico dos leitos vasculares. Portanto, ainda é possível observar o barorreflexo, que é calculado sobre as alterações cardíacas. Embora o Gop nos animais anestesiados tenha sido igual à preparação, o mecanismo barorreflexo não foi suficiente para controlar a PAM nesses animais. Portanto, sugerimos 90 que a presença de isoflurano adiciona um aspecto confuso para a interpretação dos dados cardiovasculares, embora tenha causado alterações relativamente pequenas. Apesar da preparação ter um valor de Gop inalterado sob anestesia, o valor de PSD de 39,90 ms2 pode ser interpretado como ausente. Ele é aproximadamente 4.700 vezes mais baixo que o valor esperado para um animal recuperado (186.834,00 ms2). Isto reafirma que a anestesia deprime partes do sistema autônomo. Este resultado indica que deve haver muita cautela ao interpretar dados funcionais obtidos em animais anestesiados. 5. Considerações finais Acompanhamos as alterações da ƒH média e VFC por 15 dias após a descerebração e identificamos a recuperação da modulação autonômica ao longo do tempo e sua manutenção em níveis adequados estáveis até o final das medições. A cascavel descerebrada apresentou capacidade regulatória do barorreflexo, indicando modulação autonômica dos parâmetros cardíacos e vasculares. Em répteis, este é o único modelo que permite registros cardiovasculares que continua fornecendo dados confiáveis equivalentes a um animal acordado em repouso no intervalo de tempo avaliado. Esta preparação pode ser útil para estudos cardiovasculares em répteis squamatos, uma vez que possibilita o registro simultâneo de múltiplas variáveis, permitindo a correlação adequada de parâmetros; reduz o número de animais utilizados; permite escapar do efeito de viés anestésico; e também, permite a investigação de processos inacessíveis em preparações in vivo. 6. 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Posteriormente, as preparações passaram por instrumentação para registro de variáveis cardiovasculares e foram submetidas à desafios autonômicos para análise de modulação hemodinâmica relacionadas às alterações de retorno venoso e perfusão cefálica, além da estimulação química de quimiorreceptores de O2. As mesmas medidas também foram realizadas após anestesia com isoflurano 2%. A alteração de retorno venoso desencadeou variações nas pressões arteriais sistêmicas (PAMsis) e pulmonares (PAMpul) com mecanismos compensatórios nas complacências vasculares e consequentemente nos fluxos sanguíneos em ambos os circuitos sistêmico e pulmonar, com acentuado desvio de sangue para o circuito pulmonar. A alteração de perfusão cefálica resultou em diminuição do débito cardíaco (DC) e PAMsis, que foram compensadas, provavelmente, através do barorreflexo e reflexo de Cushing. O estímulo aos quimiorreceptores de O2 causou aumento na condutância e fluxo pulmonar e pronunciado desvio sanguíneo para o circuito pulmonar. Após o fim dos desafios, todos os parâmetros retornaram para seus estados basais. A anestesia com 2% de isoflurano atenuou as respostas demonstrando a natureza autonômica da modulação cardiovascular observada. As preparações foram capazes de realizar regulações complexas que envolveram respostas primárias e secundárias compensatórias frente às manobras realizadas. A preservação das respostas credita confiabilidade para uso do modelo em experimentação de longa duração. Palavras-chave: répteis, head lift, tail lift, ortostase, quimiorreceptor, SNA, cianeto, descerebração. 99 1. Introdução Os répteis constituem uma classe de vertebrados que ocupam posição estratégica na cadeia evolutiva de forma que estes animais são interessantes para investigações sobre mecanismos, adaptações e interações de diferentes sistemas fisiológicos. Muitas das informações básicas sobre a função cardiovascular de répteis foram obtidas com o uso de abordagens in situ para o registro de múltiplos parâmetros fisiológicos. Neste procedimento, o monitoramento é realizado em animais sob anestesia terminal (Wang et al., 2003; Galli et al., 2005; Keen et al., 2016, Willians et al., 2021). Contudo, o uso de anestésico pode trazer efeitos indesejados, atenuando ou exacerbando alguns dos parâmetros fisiológicos de interesse. Da mesma forma, pode haver alteração ou bloqueio de mecanismos modulatórios autonômicos (Lee et al., 2002, Lee et al., 2004, Mosley et al., 2004, Yu et al., 2004 Ioannou et al., 2013, Ghali e Ghali, 2021). Tais efeitos possuem impacto relevante no estudo de mecanismos e função cardiovascular. O uso da descerebração como procedimento em experimentação animal é antigo e já foi utilizado em diversas espécies, como gatos (Tenney e Ou, 1977; Whelan, 1996), cães (Nielsen et al., 1986; Tonkovic-Capin et al., 1998), ratos (Woods, 1964; Smith et al., 2001; Tsuchimochi et al., 2010), coelhos (Blake e Korner, 1982; Clarke e Harris, 2001), sapos (Wang et al., 1999; Gargaglioni et al., 2007), tartarugas (Takeda et al., 1986; Sarrafizadeh et al., 1996) e peixes (Reid et al., 2003; Burleson e Silva, 2011). Esta técnica, originalmente, visa a inviabilização de áreas especificas do SNC para a investigação de sua função. Contudo, seu uso pode ser indicado para prover preparações eutanasiadas, em procedimentos de grande invasividade, sem anestesia (Silverman et al., 2005). Outra vantagem emergente de tais preparações é que a possibilidade de executar múltiplos registros fisiológicos, mesmo que sob instrumentação profunda, aumenta a possibilidade de interação e confiabilidade nos dados e pode reduzir consideravelmente o número de espécimes utilizadas, atendendo diretrizes éticas e o princípio dos 3Rs (Graham e Prescott, 2015). Na presente investigação, a descerebração foi planejada de forma a preservar os núcleos do SNA e assim, manter a capacidade de modulação autonômica para ajustes cardiovasculares. Para avaliar a presença de tais ajustes, utilizamos desafios que provocam alterações dinâmicas transitórias na regulação do sistema cardiovascular e fornecem uma visão global sobre sua capacidade de modulação para manutenção da estabilidade funcional (Lillywhite, 1987; Taylor et al., 1999; Armelin et al., 2019). O modelo foi testado, 100 inicialmente, 24h após a descerebração (Rocha et al., 2021) e apresentou respostas cardiovasculares complexas a tais testes. Contudo, ele aparenta constância e estabilidade e assim, esta pode ser uma boa preparação para protocolos mais longos e duradouros. Para tal uso, ele precisa ser testado garantindo que ele seja capaz de manter o funcionamento dos sistemas fisiológicos em nível estável ao longo do tempo. Os testes autonômicos propostos visam à estimulação de proprioceptores cardiovasculares com potencial de iniciar modulações complexas que envolve o trabalho cardíaco e de múltiplos segmentos vasculares, como barorreflexo, receptores de baixa pressão, receptores de perfusão cefálica (Cushing) e/ou quimiorreceptores (Lillywhite e Gallagher, 1985; Leite et al., 2007, Belão et al., 2015; Armelin et al., 2014, 2019; Troiano et al., 2018). Esses mecanismos tem o potencial de desencadear uma série de ajustes na frequência cardíaca, alterações no volume sistólico, força de contração, e consequentemente do débito cardíaco; pressão arterial, complacência, condutância periférica, modulação do retorno venoso e também, ajustes de desvio sanguíneo (Rocha et al., 2021). Parte destes, apesar de terem sido relatados anteriormente, nunca foram propriamente descritos em répteis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar se o modelo de cascavel descerebrada é capaz de manter os ajustes autonômicos cardiovasculares complexos ao longo tempo após a descerebração. 2. Materiais e métodos 2.1 Animais experimentais As cascavéis Sul Americanas, Crotalus durissus, (n = 8, massa = 852,0 ± 43,41g, média ± EPM) utilizadas foram doadas pelo Instituto Butantan e mantidas no Departamento de Ciências Fisiológicas, UFSCar, até o momento dos experimentos. Os animais foram mantidos em caixas individuais em sala com temperatura controlada, 28ºC e fotoperíodo 12:12, com água ad libitum, e alimentados com roedores a cada 15 dias. A alimentação foi interrompida 15 dias antes de cada experimento e o projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética (CEUA- UFSCar). 2.2 Cirurgias de descerebração e instrumentação 101 O procedimento de descerebração realizado foi previamente descrito por Rocha e colaboradores (2021). Para procedimentos cirúrgicos, os animais foram inicialmente sedados com aumento de PCO2 (Wang et al., 1993; Leite et al., 2013, 2014) até perda de seu controle motor, permitindo manuseio seguro e intubação endotraqueal para ventilação mecânica com 3-5% do anestésico inalável isoflurano. Sob anestesia, uma pequena abertura medial (~ 2-3 mm) foi feita no crânio. A artéria subjacente e qualquer eventual vaso colateral foram cuidadosamente cauterizados e as meninges suavemente puncionadas e abertas. Todo tecido nervoso compreendendo o teto óptico e suas estruturas rostrais foram cauterizados e removidas. As estruturas neurais do cerebelo, tronco encefálico e porção posterior do hipotálamo permaneceram intactas. A incisão na cabeça foi posteriormente suturada. Ao fim do procedimento as preparações receberam tratamento profilático com injeção intraperitoneal de antibiótico (Enrofloxacina 11 mg·kg-1) e anti-inflamatório (Flunixina meglumina 1,1 mg·kg-1). A descerebração, como procedimento irreversível que proporciona um estado irrecuperável, foi considerada o momento da eutanásia (Silverman et al., 2005; Rocha et al., 2021; Castro et al., 2021). Todas as diretrizes éticas para a instrumentação animal continuaram sendo respeitadas enquanto a preparação estava em uso. Após 15 dias de recuperação (tempo previamente determinado por protocolos anteriores), realizou-se a segunda cirurgia para implantação de cânulas e sondas de fluxo que nos permitiu registrar os parâmetros cardiovasculares de interesse. Durante o segundo procedimento cirúrgico, para minimizar a exposição à possíveis efeitos causados pelo anestésico sobre o sistema nervoso autônomo (SNA), a anestesia inalatória foi reduzida (5- 1%) e associada à bloqueio neuromuscular (Brometo de pancurônio - 0,5 mg·kg-1). Após a anestesia, foi realizada incisão ventrolateral (~ 4,5 cm) do lado direito, rostral ao coração, para expor a vasculatura central. Canulações oclusivas da artéria vertebral (cânula de polietileno, PE50) e de um ramo da artéria pulmonar (PE20) proporcionaram acesso ao arco aórtico direito e à artéria pulmonar, respectivamente, e permitiram assim, o registro da pressão arterial pulmonar média (PAMpul) e sistêmica (PAMsis). Os cateteres foram preenchidos com solução salina (0,9%) heparinizada (50 UI/ml). Além disso, sondas de fluxo perivascular foram fixadas no arco aórtico esquerdo e artéria pulmonar, para registro do fluxo sanguíneo do arco aórtico esquerdo e do circuito pulmonar, respectivamente (?̇?Lao e ?̇?pul, 1,5PR - 1,5PR, Transonic Systems). As sondas foram envolvidas com gel de ultrassom para permitir e estabilizar a transmissão do sinal e fixadas 102 na borda da incisão ventrolateral para estabilidade da posição. Ao final do procedimento, cânulas e sondas foram externalizadas (através da incisão) e fixadas com sutura no dorso da preparação. Após a instrumentação, cada preparação foi posicionada em decúbito ventral e a anestesia foi retirada. As preparações receberam anestésico local (lidocaína 2%) nos pontos de incisão, além tratamento profilático com injeção intraperitoneal de antibiótico (Enrofloxacina 11 mg·kg-1) e anti-inflamatório (Flunixina meglumina 1,1 mg·kg-1). 2.3 Protocolo experimental Os registros das variáveis cardiovasculares começaram 24 horas após a cirurgia de instrumentação. Para isso, os cateteres foram conectados à transdutores de pressão (Baxter Edward PX600) e acoplados à pré-amplificadores de sinal (Bridge Amp, ADInstruments). Os transdutores de pressão foram calibrados contra uma coluna de mercúrio. As sondas de fluxo foram conectadas à um medidor de fluxo sanguíneo de canal duplo para transdução e amplificação (Transonic Systems). Todos os sinais foram continuamente (1k·seg-1) processados em um conversor analógico-digital e registrados (software Powerlab/LabChart®, ADInstruments). Para evitar que movimentos eventuais alterassem os registros e/ou posicionamento de sondas, as preparações receberam injeção intravascular de bloqueador de placa motora (Brometo de pancurônio - 0,5 mg·kg-1) e permaneciam na ventilação mecânica (3-5 respirações × min-1). A dose de pancurônio não alterou os parâmetros cardiovasculares aferidos. Manobras de posicionamento foram utilizados para gerar os desafios ao sistema cardiovascular. Estes se basearam em alterações hemodinâmicas decorrentes de variações posturais dentro do escopo fisiológico da espécie. As manobras envolveram levantamento da porção rostral do corpo (da cabeça até a porção anterior ao coração - Head Lift, HL), e a porção posterior do corpo (da cauda até o ponto médio do comprimento corpóreo - Tail Lift, TL). A manobra HL causa impacto na perfusão da porção rostral do corpo do animal, notoriamente na perfusão cefálica e foi realizada levantando a cabeça juntamente com primeiro terço do corpo, anterior a posição do coração, 15-20 cm da posição horizontal. Esta posição foi mantida por 3 minutos. Após isto, o animal retornava à posição inicial. A estabilização dos parâmetros foi seguida pela segunda manobra. O TL provoca aumento imediato no retorno venoso. A porção final do corpo foi levantada 20-30 cm da posição 103 horizontal por 3 minutos, com retorno a posição inicial de repouso até estabilização dos parâmetros. As manobras foram seguidas pelo estímulo químico aos quimiorreceptores de O2. Para tal, utilizamos injeção de cianeto de sódio (NaCN), substância utilizada de forma recorrente para estimular quimiorreceptores periféricos sensíveis ao O2 em diversos grupos de vertebrados (Ishii e Kusakabe, 1985; Leite et al., 2007; Taylor et al., 2010; Belão et al., 2015). As injeções foram aplicadas através da cânula da artéria vertebral em três concentrações (10, 50 e 100 μg·kg-1) diluídas em solução salina (NaCl 0,9%). Uma injeção de solução salina foi utilizada como controle. Foi aguardado que todos parâmetros retornassem à linha de base antes de cada nova dose. Os registros das variáveis ocorreram continuamente ao longo de todo protocolo. Após 24 horas, o protocolo experimental foi repetido com os animais anestesiados com isoflurano. Após o término de todos os protocolos experimentais, as preparações receberam injeções intravenosas de Tiopental (100 ml·kg-1 - Pearson, Brasil) seguido de solução hiper saturada de KCl. 2.4 Análise de dados e estatística Para os cálculos das pressões arteriais médias sistêmica e pulmonar (PAM = 1/3 Psistólica + 2/3 Pdiastólica · ƒH) foi utilizado o sinal derivado de PAMsis e PAMpul. O fluxo sanguíneo sistêmico (?̇?sis) foi calculado a partir do registro de ?̇?Lao usando os fatores de correção ?̇?sis = 2,6 · ?̇?Lao (Filogonio et al., 2014) e ?̇?sis = 3,3 · ?̇?sis (Galli et al., 2005) para cascavéis em repouso e anestesiadas, respectivamente. O débito cardíaco (DC) foi calculado como a soma de ?̇?sis e ?̇?pul. O volume sistólico total (pulmonar + sistêmico) foi calculado como ?̇?sis·ƒH-1 (Crossley et al., 1998; Galli et al., 2005). As condutâncias vasculares sistêmica e pulmonar foram calculadas como G = ?̇?·P-1 (Lautt, 1989; O’Leary, 1991). A direção do desvio foi indicada pela razão: ?̇?pul·?̇?sis -1 (Hicks e Comeau, 1994). Esse índice indica desvio D-E quando os valores de razão são <1 e desvio E-D quando os valores são > 1 (Hicks et al., 1996). Para a análise estatística foi utilizado o teste de normalidade Shapiro-Wilk. Em relação ao desafio ortostático, analisamos 5 pontos ao longo do tempo, período de repouso, HL/TL on (início da manobra), resposta secundária, HL/TL off (retorno à posição 104 horizontal) e recuperação (2 minutos após o fim da manobra). Para avaliar as alterações cardiovasculares causadas pelas manobras e pelo cianeto, assim como possíveis interferências da anestesia, foi utilizado a ANOVA Two-Way seguida do teste Sidak (P <0,05; n = 8; GraphPad Prism 7.0). 3. Resultados 3.1 Redução da perfusão cefálica Ao início de HL, a preparações não anestesiadas apresentaram duas respostas ao longo dos 3 minutos (Figuras 1 e 2). A resposta primária aconteceu imediatamente após mudança de posição sendo observada entre os primeiros 10 a 20 segundos. Ao longo do tempo, em torno de 70 a 100 segundos, observamos uma resposta secundária, compensatória e mais proeminente do que a resposta inicial. A ƒH (37,08 ± 3,04 bpm) foi a mais afetada pela manobra com queda (33,73 ± 3,28 bpm) seguida de aumento (39,44 ± 3,12 bpm). Ao final da manobra houve nova redução de fH (36,61 ± 3,57 bpm). A PAMsis (4,96 ± 0,37 kPa) se elevou como resposta secundária (5,71 ± 0,43 kPa), o oposto do que ocorreu com o ?̇?sis (17,94 ± 3,54 ml·min-1·kg-1) e Gsis (3,91 ± 0,89 ml·min-1·kg-1·kPa-1) que diminuíram nessa mesma resposta secundária (15,21 ± 2,78 ml·min-1·kg-1 e 2,74 ± 0,50 ml·min-1·kg-1·kPa-1, respectivamente). PAMpul (2,61 ± 0,30 kPa) também apresentou maior elevação na resposta secundária (2,95 ± 0,38 kPa), o oposto de Gpul (9,16 ± 1,89 ml·min-1·kg-1·kPa-1) que diminuiu nesse mesmo momento (6,59 ± 1,10 ml·min-1·kg-1·kPa-1), o que não foi acompanhada pelo ?̇?pul que não se alterou ao longo da manobra. DC (40,49 ± 4,92 ml·min- 1·kg-1) se elevou na resposta secundária (50,1 ± 6,33 ml·min-1·kg-1) em relação ao início da manobra (HL on 33,2 ± 4,77 ml·min-1·kg-1), mas nenhum dos momentos foram diferentes do repouso. Vstot e a taxa de desvio também não sofreram alteração durante a manobra. Nas preparações anestesiadas, a maioria dos parâmetros não sofreu alteração. ?̇?sis (22,58 ± 8,00 ml·min-1·kg-1) se elevou no início de HL (29,23 ± 8,92 ml·min-1·kg-1) e caiu na resposta secundária (20,24 ± 6,37 ml·min-1·kg-1). Padrão semelhante foi observado em Gsis (4,33 ± 0,95 ml·min-1·kg-1·kPa-1), DC (42,92 ± 9,92 ml·min-1·kg-1) e Vstot (1,1 8 ± 0,24 ml·kg-1). As principais diferenças neste parâmetros ocorreram entre seus valores no início (6,35 ± 1,49 ml·min-1·kg-1·kPa-1; 49,98 ± 10,59 ml·min-1·kg-1; 1,39 ± 0,24 ml·kg-1) e final 105 da manobra (3,35 ± 0,77 ml·min-1·kg-1·kPa-1; 35,31 ± 7,29 ml·min-1·kg-1; 0,99 ± 0,17 ml·kg- 1). As variáveis ƒH, Gsis, Gpul, DC e Vstot responderam de forma diferente entre preparações não anestesiadas e anestesiadas (Figuras 1 e 2). Figura 1. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Head Lift. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 106 Figura 2. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Head Lift. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul·?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 107 3.2 Aumento de retorno venoso Ao início de TL, houve uma resposta imediata (primeiros 10 segundos) e posteriormente, uma resposta secundária (por volta dos 70 segundos). A resposta mais pronunciada foi observada no início da manobra (Figuras 3 e 4). Nas preparações não anestesiadas, a ƒH (35,7 ± 1,79 bpm) se mostrou menos alterada neste desafio com queda somente no início de TL (32,35 ± 2,45 bpm). PAMsis (5,10 ± 0,32 kPa) e ?̇?sis (18,62 ± 2,59 ml·min-1·kg-1) apresentaram padrão de respostas opostas com elevação da pressão e diminuição do fluxo em TL (5,51 ± 0,35 kPa; 13,36 ± 2,35 ml·min-1·kg-1, respectivamente). PAMpul (2,41 ± 0,31 kPa) assim como a sistêmica, aumentou no início da manobra (2,65 ± 0,32 kPa) acompanhado do ?̇?pul (18,72 ± 4,18 ml·min-1·kg-1) que apresentou a mesmo padrão de resposta (25,42 ± 4,94 ml·min-1·kg-1). As condutâncias, Gsis (4,72 ± 0,67 ml·min- 1·kg-1·kPa-1) e Gpul (7,28 ± 1,50 ml·min-1·kg-1·kPa-1), apresentaram respostas opostas com diminuição (2,82 ± 0,49 ml·min-1·kg-1·kPa-1) e aumento (11,08 ± 2,19 ml·min-1·kg-1·kPa-1), respectivamente, no início da manobra. DC (37,28 ± 4,75 ml·min-1·kg-1) diminuiu na resposta secundária (35,29 ± 5,02 ml·min-1·kg-1) em relação à inicial (41,08 ± 5,44 ml·min- 1·kg-1). Vstot (1,05 ± 0,12 ml·kg-1) e taxa de desvio (1,02 ± 0,26) apresentaram aumento no momento inicial de resposta (1,26 ± 0,15 ml·kg-1; 1,79 ± 0,49). As preparações anestesiadas igualmente ao HL, apresentaram menor variação de respostas. A principal alteração foi na PAMsis (4,08 ± 0,49 kPa) que apresentou maior diferença com aumento no início de TL (4,48 ± 0,54 kPa) e queda ao final da manobra (3,91 ± 0,19 kPa). Esse perfil de resposta também foi observado em PAMpul (2,81 ± 0,24 kPa, no início; e 2,50 ± 0,20 kPa, ao final) e ?̇?pul (23,37 ± 3,47 ml·min-1·kg-1, no início; e 18,43 ± 3,36 ml·min-1·kg-1, ao final). O desvio foi maior no início (1,71 ± 0,28) que no fim da manobra (1,21 ± 0,26). As variáveis ƒH, PAMsis, ?̇?pul, Gpul, DC e Vstot diferem entre preparações não anestesiadas e anestesiadas (Figuras 3 e 4). 108 Figura 3. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Tail Lift. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 109 Figura 4. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano na manobra Tail Lift. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul·?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 110 3.3 Estímulos de quimiorreceptores O efeito do NaCN observado nos parâmetros cardiovasculares está representado abaixo nas figuras 5 e 6. Nas preparações não anestesiadas, a ƒH e os parâmetros relacionados à perfusão do circuito sistêmico, PAMsis, ?̇?sis e Gsis, não apresentaram alterações em relação ao repouso (Figuras 5 e 6). Houve alterações no circuito pulmonar com alterações em PAMpul (2,50 ± 029 kPa), ?̇?pul (18,45 ± 3,77 ml·min-1·kg-1) e Gpul (8,05 ± 1,24 ml·min-1·kg-1·kPa-1), que aumentaram após as injeções de 50 μg·kg-1 (3,10 ± 0,27 kPa; 36,17 ± 5,52 ml·min-1·kg-1; 12,71 ± 1,67 ml·min-1·kg-1·kPa-1, respectivamente) e 100 μg·kg-1 (3,15 ± 0,28 kPa; 36,95 ± 4,74 ml·min-1·kg-1; 12,71 ± 1,41 ml·min-1·kg-1·kPa-1, respectivamente) assim como DC (salina, 36,61 ± 3,91 ml·min-1·kg-1; 50 μg·kg-1, 55,4 ± 4,62 ml·min-1·kg-1; 100 μg·kg-1, 57,69 ± 5,06 ml·min-1·kg-1) e taxa de desvio (salina, 1,09 ± 0,23; 50 μg·kg-1, 2,63 ± 0,95; 100 μg·kg-1, 2,97 ± 0,96). Vstot (1,01 ± 0,11 ml·kg-1) aumentou somente após a administração do maior estímulo (1,61 ± 0,25 ml·kg-1). A anestesia praticamente aboliu as respostas. Houve alteração de PAMpul (2,24 ± 0,19 kPa), que aumentou nas concentrações de 50 (2,55 ± 0,24 kPa) e 100 μg·kg-1 (2,72 ± 0,34 kPa). O perfil de resposta de PAMpul, ?̇?pul, Gpul, DC, Vstot e desvio sanguíneo diferiram entre preparações não anestesiadas e anestesiadas (Figuras 5 e 6). 111 Figura 5. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano perante desafio de quimiorrecepção ao NaCN. A) ƒH – frequência cardíaca; B) DC – débito cardíaco; C) PAMsis – pressão arterial média sistêmica; D) PAMpul – pressão arterial média pulmonar. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 112 Figura 6. Variáveis cardiovasculares de cascavel Sul Americana (Crotalus durissus) descerebrada com e sem presença de anestésico isoflurano perante desafio de quimiorrecepção ao NaCN. A) ?̇?sis – fluxo sanguíneo sistêmico; B) ?̇?pul – fluxo sanguíneo pulmonar; C) Gsis – condutância sistêmica; D) Gpul – condutância pulmonar; E) Vstot – volume sistólico total e F) ?̇?pul· ?̇?sis – taxa de desvio sanguíneo. Linha contínua e letras maiúsculas – preparação descerebrada sem anestesia. Linha pontilhada e letras minúsculas – preparação descerebrada sob anestesia. Letras diferentes denotam diferença estatística. Asterisco denotam diferença entre preparações com e sem anestesia (Two-Way ANOVA/Sidak, p<0,05, n=8). 113 4. Discussão O sistema nervoso autônomo é responsável por modular os parâmetros cardiovasculares para dar suporte as atividades e funções do organismo. Centros especializados que atuam captando possíveis alterações, como barorreceptores ou receptores de baixa pressão, trabalham para detectar alterações hemodinâmicas. Na natureza, os animais se deparam com diversas situações que exigem regulações autonômicas instantâneas para manter a homeostasia e adequação do suporte cardiovascular. Testes de alterações posturais de elevação da cabeça e da cauda realizadas no presente trabalho, utilizam a alteração hemodinâmica decorrente a ação da gravidade sobre o sangue para respectivamente, reduzir o fluxo sanguíneo para cabeça e órgãos rostrais ou facilitando o retorno venoso (Lillywhite et al., 1996; Armelin et al., 2019; Rocha et al., 2021). No presente trabalho observamos que o modelo foi capaz de responder às manobras e realizar ajustes cardiovasculares para reestabelecimento das pressões arteriais, bem como modulação vasculares e alteração do desvio sanguíneo. Tanto em HL como em TL, foi possível observar respostas primárias e secundárias em diversos parâmetros. O último desafio utilizou o NaCN para estimular quimiorreceptores de O2, mimetizando uma condição de hipoxemia (Leite et al., 2007; Belão et al., 2015). A manobra resultou em aumento do desvio sanguíneo para circuito pulmonar com magnitude dose-dependente. A anestesia causou atenuação das respostas e inalteração de parâmetros validando a natureza autonômica dos ajustes cardiovasculares observados. As respostas observadas foram obtidas com animais descerebrados por 15 dias, indicando persistência dos processos modulatórios e validando esta preparação para estudo de longa duração. Redução da perfusão cefálica A alteração da posição com o levantamento da cabeça, apesar de parecer um movimento simples, incorre na necessidade de ajustes compensatórios muito importantes. Esta posição tende a diminuir a perfusão tecidual nas áreas acima da linha do coração e afetam diretamente a oxigenação do encéfalo. Em casos artificiais, com verticalização corpórea total, a postura pode ocasionar queda imediata no débito cardíaco e pressão arterial em um fenômeno chamado de hipotensão ortostática (Lillywhite, 1996; Armelin et al., 2014). Contudo, este é um caso extremo, no qual há aumento do gradiente de pressão 114 hidrostática nas partes inferiores do corpo e consequentemente, aumento no volume de sangue nessas áreas e diminuição do retorno venoso (Lillywhite, 1987). Em nosso experimento não há redução de retorno venoso, mas limitação de perfusão rostral. No caso, pudemos observar ajuste para promover maior perfusão sistêmica na resposta inicial ao HL (nas preparações não anestesiadas), com aumento relativo (à segunda fase da resposta) de DC, Gsys e Qsys, mesmo contra redução relativa da fH. Vanloon e colaboradores (1993) afirmam que a isquemia cerebral é fator desencadeante de ativação simpática e produção de catecolaminas, fator relacionado com o reflexo de Cushing (Paton et al., 2009; Schmidt et al., 2018). Esses fatores podem ter contribuído com a resposta para priorização da perfusão sistêmica (Altimiras et al, 1997; Taylor et al., 2014). A queda nos valores da ƒH logo no início da manobra é oposta ao encontrado em testes ortostáticos, no qual há alteração do retorno venoso, conforme relatado para píton, jiboia e iguana (Armelin et al., 2014, 2019; Troiano et al., 2018). Indicamos que a elevação secundária da ƒH com elevação de PAM, que junta à redução de Gsis e Gpul provê condições para desvio de fluxo sanguíneo para a região cefálica. Tal ajuste indicaria diversos aspectos relevantes. Ele estaria relacionado a um forte e ativo reflexo de Cushing e, primeiro, indicaria sua existência em répteis. Tal reflexo nunca foi descrito neste grupo. Além disto, os proprioceptores relevantes para tal reflexo teriam que estar localizados nas áreas remanescentes do SNC do animal descerebrado. Por fim, com base nos resultados, indicamos que os ajustes vasculares seriam fundamentais para tal ajuste de fluxo sanguíneo para a região cefálica. HL não afetou o fluxo pulmonar. Sua estabilização, a despeito do aumento relativo da perfusão sistêmica, indica participação compensatória do shunt neste ajuste. E assim como esperado, ao final da manobra todos os parâmetros retornaram a níveis semelhantes ao repouso. A anestesia abole a resposta da maioria dos parâmetros cardiovasculares analisados. Anestésicos inalatórios como isoflurano, enflurano e halotano alteram a distensibilidade de vasos, com aumento da complacência vascular e vasodilatação (Akata et al., 1995; Hettrick et al., 1996; Ioannou et al., 2013). Os parâmetros de ƒH, DC, Vstot e as condutâncias sistêmica e pulmonar foram afetados pela presença da anestesia quando comparados às preparações não anestesiadas, o que indica que o controle da resistência vascular periférica e retorno venoso podem ser mais afetados sob efeito de anestesia. 115 Aumento do retorno venoso Diferentes atividades que geram aumento do metabolismo, tais como atividade física e/ou digestão, geram respostas rápidas em parâmetros cardiovasculares que garantem um aporte maior de sangue e, consequentemente, de O2 para os tecidos em maior atividade. O excedente de sangue para tais manobras é retirado da seção venosa, onde está a maior parte do volume vascular (Secor e White, 2010; Bovo et al., 2015; Leite et al., 2013, 2014; Enok et al., 2016; Wang et al., 2019). TL aumenta o retorno venoso e com maior enchimento cardíaco, há maior volume de ejeção sistólica, débito cardíaco resultando em elevação na pressão arterial. Mesmo sem modulação, o coração é capaz de gerar mais força contrátil através de Frank-Starling. Além disso, o alongamento do tecido atrial e nodal sinoatrial e miocárdio, provocando aumento de despolarização do marcapasso cardíaco elevando a frequência cardíaca (Guyton et al., 1955; Gelman, 2008; Berlin e Bakker, 2014; Joyce e Wang, 2020). Estes ajustes fazem com que um eventual aumento de retorno venoso seja imediatamente bombeado para a seção arterial, por aumento no DC. No presente trabalho, observamos imediato aumento de PAMsis, PAMpul e Vstot após elevação da cauda. Em resposta à elevação da PAMsis, houve diminuição da ƒH, provavelmente por resposta barorreflexa. O aumento do bombeamento cardíaco foi primariamente desviado para o circuito pulmonar, com menor resistência, aumentando ?̇?pul e o desvio E-D. As respostas vasculares compuseram o ajuste secundário com redução de Gsis. Contudo, nosso protocolo não permite diferenciar reduções de Gsys modulada autonomicamente de reduções decorrentes do efeito da gravidade por estarmos artificialmente elevando a porção caudal da preparação. Achados semelhantes foram observados em estudos prévios com atividade induzida em répteis (Hicks e Krosninunas, 1996; Frappel et al., 2002; Krosniunas e Hicks, 2003; Filogonio, et al., 2016). A condutância sistêmica é alterada pelo tônus vascular periférico e este é regulado pelo sistema nervoso autônomo e sinalizadores locais (Joyce e Wang, 2020). Acreditamos que tais fatores contribuam para a resposta secundária da ƒH que volta a se elevar e retorna para seu valor de repouso e assim permanece até o fim da manobra. Assim como em HL, ao final da manobra de TL os parâmetros cardiovasculares retornaram aos valores iniciais de repouso. As preparações anestesiadas não apresentaram as mesmas regulações perante a manobra do TL. Na maioria dos parâmetros as alterações causadas pelo início do TL se 116 mantiveram assim até o término do desafio que pode ter sido originadas somente pelo acúmulo de sangue em consequência da inclinação. A PAMsis foi a mais afetada nas preparações anestesiadas indicando que a alteração no bombeamento é composta de efeitos locais e que os ajustes observados na preparação sem anestesia possuem componentes autonômicos. Estímulos de quimiorreceptores Os quimiorreceptores de O2 periféricos são compostos pelas células Glomus que atuam detectando alteração na pressão parcial de O2 no sangue. Em mamíferos, eles estão localizados nas artérias carótida comum e aorta. Em répteis estariam localizadas ao redor da carótida e algumas de suas ramificações (Marshall, 1994; Milson e Burleson, 2007; Taylor et al., 2010). O NaCN tem sido utilizado como agente ativador de quimiorreceptores de O2 em diversos vertebrados (Franchini e Krieger, 1993; Leite et al., 2007, Nůsková et al., 2010; Belão et al., 2015; Reichert et al., 2015). Marshall (1994) relata que as respostas ao cianeto podem ser difíceis de compreender. Estudos com diversos mamíferos (cães, gatos, coelhos, focas, macacos e humanos) demonstram que existem dois padrões de respostas, uma bradicardia inicial seguida de taquicardia. Contudo, essas respostas podem variar de acordo com a concentração do NaCN, local de injeção ou ainda com a utilização de ventilação artificial. Apesar de possuir interpretação confusa, em muitos casos, seu efeito nas estimulação de quimiorreceptores é claro. Em nossas preparações, a estimulação pelo NaCN não causou efeitos na perfusão sistêmica e Gsis e ?̇?sis forma mantidas inalteradas. Por outro lado, houve efeito acentuado no DC e perfusão do circuito pulmonar, após as injeções de 50 e 100 µg·kg-1. Este resultado indica ajuste cardiovascular fino ao direcionar fluxo, preferencialmente, à capitação de O2. O aumento na Gpul com consequente elevação no fluxo pulmonar e aumento no desvio sanguíneo E-D podem ter contribuído para aumento na PAMpul também observada nessas concentrações. Resultados semelhantes ao aumento do ?̇?pul e desvio D-E em resposta à hipóxia foram reportados e discutido por outros autores (Burggren, 1977, 2020; West et al., 1992; Wang e Hicks,1996). É interessante que tenha havido alterações importantes no circuito pulmonar enquanto o sistêmico permaneceu estável. Isto indica uma regulação de desvio sanguíneo para aumento em resposta a desoxigenação sanguínea. Apesar da relação entre aumento metabólico e desvio sanguíneo ter sido demonstrado diversas vezes, ajustes 117 de desvio em resposta a quimiorreceptores de O2 nunca haviam sido demostrados. Além disto, este ajuste reforça a presença de uma modulação ativa para o desvio sanguíneo e o possível papel da artéria pulmonar neste processo. A possibilidade de os padrões de desvio serem resultados secundários de ajustes de resistência periférica nos circuitos sistêmico e pulmonar perde relevância. As preparações anestesiadas apresentaram aumento na PAMpul. Sem a alteração de outros parâmetros, a elevação da pressão pulmonar em si não parece indicar modulação direcional com relevância fisiológica. Assim, mais uma vez, a presença de anestésico impediu a realização de ajustes cardiovasculares perante a manobra. 5. Considerações finais A utilização de animais anestesiados na pesquisa é bastante recorrente e se faz necessário em casos que haja necessidade de registros simultâneos de diferentes parâmetros. Contudo, muitos estudos indicam que o uso de anestésicos pode alterar, atenuar ou mesmo, abolir a modulação de parâmetros cardiovasculares (Rooney et al., 1999; Lee et al., 2002, Lee et al., 2004, Galli et al., 2005). A preparação descerebrada permite cirurgias de instrumentação profundas com implante de diferentes instrumentos e, consequentemente, o registro de diversas variáveis ao mesmo tempo, sem a necessidade da utilização de anestésicos durante os protocolos, uma vez que a preparação já está eutanasiada. Os protocolos adotados no presente trabalho forneceram respostas satisfatórias na defesa do uso da preparação descerebrada em biologia experimental. As variáveis cardiovasculares desencadearam respostas imediatas frente a HL e TL, mostrando capacidade de ajuste e resolução rápida do sistema nervoso autônomo, visto que as respostas primárias para os dois desafios foram de aproximadamente 10 segundos. As respostas vasculares sistêmica e pulmonar embora sofram bastante alteração no início dos desafios utilizados, apresentaram capacidade de adaptação e ajuste para, juntamente com as PAMsis e PAMpul, devolver o equilíbrio para os fluxos sanguíneos, DC e Vstot. Estudos aprofundados sobre a participação vascular podem nos fornecer informações detalhadas sobre a participação desse ramo nos ajustes hemodinâmicos. 6. Referências 118 Akata, T., Nakashima, M., Kodama, K., Boyle, W.A., Takahashi, S. Effects of volatile anesthetics on acetylcoline-induced relaxation in the rabbit mesenteric resistance artery Anesthesiology, 82, 188-204 (1995). Altimiras, J., Aissaoui, A., Tort, L. and Axelsson, M. Cholinergic and Adrenergic Tones in the Control of Heart Rate in Teleosts. How Should They be Calculated? Comparative Biochemistry Physiology, 118, 131–139 (1997). Armelin, V.A., Braga, V.H.S., Abe, A.S., Rantin, F.T. and Florindo, L.H. 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O controle do SNA sobre a Variabilidade da Frequência Cardíaca e o barorreflexo ocorre a partir de informações aferentes, e por meio de uma complexa interação de estímulos, respostas das vias simpática e parassimpática são formuladas e modificam a ƒH e pressão arterial média, adaptando-as às necessidades de cada momento. As preparações descerebradas apresentaram mudanças nos padrões da VFC e barorreflexo ao longo dos dias subsequentes à cirurgia, com aumento progressivo nos parâmetros representativos, o PSD e Ganho barorreflexo, com perfil de recuperação a valores semelhantes aos animais intactos. Alta VFC e Gop são sinais de boa recuperação e funcionalidade, caracterizando uma preparação com mecanismos autonômicos eficientes e representativos de um animal intacto. Os resultados de desafio hemodinâmicos foram igualmente satisfatórios. As manobras de head e tail lift desencadearam ajustes cardiovasculares dinâmicos e complexos para manutenção cardiovascular. Assim também aconteceu com a estimulação dos quimiorreceptores periféricos através do NaCN, cujas preparações responderam para modular o fluxo sanguíneo para o circuito pulmonar. A capacidade de modular o desvio intracardíaco para sua participação rápida em ajustes hemodinâmicos nunca havia sido relatada. Observamos ainda, que as preparações submetidas ao anestésico isoflurano tiveram as respostas cardiovasculares limitadas ou abolidas, indicando a necessidade de cautela na interpretação de dados gerados em animais anestesiados. Por fim, concluímos que o modelo é apto para utilização em pesquisas dos mecanismos fisiológicos e tem potencial para estudos futuros que necessitem de longa duração, como estudos de fármacos, hormônios, desidratação, modulações metabólicas, estimulação de nervos, etc. Entre as vantagens que a preparação pode fornecer listamos a suspensão do uso de anestesia, a possibilidade de multi-instrumentação, permitindo a coleta de diversos parâmetros ao mesmo tempo e, consequentemente, o uso de menor número de animais.