Universidade Federal de São Carlos Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Departamento de Botânica – Laboratório de Biotecnologia de Algas Leonardo Murilo Aoyagi Manipulação das condições ambientais em culturas de Kirchneriella contorta: efeitos na fotossíntese e no rendimento de biomoléculas de valor agregado SÃO CARLOS – SP 2021 2 Universidade Federal de São Carlos Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Departamento de Botânica – Laboratório de Biotecnologia de Algas Leonardo Murilo Aoyagi Manipulação das condições ambientais em culturas de Kirchneriella contorta: efeitos na fotossíntese e no rendimento de biomoléculas de valor agregado Trabalho de conclusão de curso submetido como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Biotecnologia Orientadora: Ana Teresa Lombardi SÃO CARLOS – SP 2021 3 Resumo Microalgas são fonte natural de produtos valiosos e possuem potencial de serem aplicadas em diversos setores produtivos. Dentre a vasta gama de biomoléculas que sintetizam, os carboidratos, proteínas e lipídeos, incluindo os carotenoides, têm importância na saúde humana. Aliada à potencialidade das microalgas como produtoras de biomoléculas, tem-se que sua produção pode ocorrer em áreas que não competem com a produção de alimento e ainda, como seres fotossintéticos que são, fixam o CO2, um gás do efeito estufa. Dada à plasticidade fisiológica das microalgas, técnicas de manipulação de sua composição bioquímica têm sido propostas para o aumento de biomoléculas. Neste estudo investigou-se a fisiológia da microalga Kirchneriella contorta sob diferentes concentrações de cobre e em duas cores de luz (diodos emissores de luz – LED), vermelha e azul. Em uma primeira etapa, sob luz branca definimos uma amplitude de concentração de cobre que não ocasionasse alteração da taxa de crescimento e em segunda etapa, culturas cultivadas nessas concentrações foram expostas às luzes branca (controle), azul e vermelha. Foram determinadas as densidade populacional e taxas de crescimento, parâmetros fotossintéticos (PhytoPAM) e concentração das biomoléculas clorofila a, carotenoides, proteínas e carboidratos. Os resultados mostraram que o aparato fotossintético foi sensível às mudanças na qualidade da luz e à presença do cobre. A partir de 1,4x10-8 mol L- 1 de Cu2+ houve um aumento da dissipação não fotoquímica NPQ, que levou à superação do estresse, mantendo os rendimentos fotossintéticos similar ao controle. As biomoléculas clorofilas a e b, carboidratos e proteínas apresentaram maiores produtividades em concentrações intermediárias de cobre nas primeiras 48 h de cultivo sob luz branca. Sob luz azul e na concentração de 3,8x10-9 mol L-1 de Cu2+ livre houve aumento de 50% na produtividade de carotenoides e carboidratos e de 30% de proteínas. As taxas de crescimento mantiveram-se sempre similares ao controle, independente da qualidade da luz ou concentração de cobre. Mostramos que, se fornecido em quantidade correta, o cobre pode estimular a produtividade de biomoléculas, e que essa produtividade pode ser magnificada por sinergismo mediante combinação com LED azul. Essa dupla mostrou-se ótima ferramenta para a manipulação bioquímica e crescimento de Kirchneriella contorta. Este estudo é uma contribuição à biotecnologia de microalgas e ao entendimento da fisiologia e efeitos do cobre e luz azul e vermelha na microalga, K. contorta uma Chlorophyta de água doce. Palavras-chave: microalga, cobre, LEDs, biomoléculas. 4 Lista de Ilustrações Figura 1 – Fluxograma do projeto ....................................................................................... 9 Figura 2 – Esquema experimental e posterior divisão para os LEDs .............................. 11 Figura 3 - Espectro de emissão dos LEDs usados no experimento ................................... 12 Figura 4 – Curva de crescimento em diferentes concentrações de cobre ........................ 17 Figura 5 – Parâmetros de crescimento em 48 horas .......................................................... 20 Figura 6 – Parâmetros de crescimento em 96 horas .......................................................... 22 Figura 7 – Parâmetros de fluorescência em 48 horas ........................................................ 23 Figura 8 – Parâmetros de fluorescência em 96 horas ........................................................ 24 Figura 9 – Produtividade específica de pigmentos em 48 horas ....................................... 26 Figura 10 – Produtividade específica de pigmentos em 96 horas ..................................... 28 Figura 11 – Produtividade específica de biomoléculas em 48 horas ................................ 29 Figura 12 – Produtividade específica de biomoléculas em 96 horas ................................ 30 Lista de Tabelas Tabela 1 - Concentrações de cobre e taxa de crescimento ................................................ 16 Tabela 2 – Concentrações de cobre 24 h antes da inoculação e cobre livre .................... 18 5 Sumário 1. Introdução ........................................................................................................... 6 2. Objetivo Geral..............................................................................................................8 2.1 Objetivos específicos .................................................................................................. 8 3. Material e métodos .............................................................................................. 9 4. Resultados e discussão ....................................................................................... 15 4.1 Varredura das concentrações de cobre em microplaca.......................................... 15 4.2 Manipulação bioquímica e fisiológica da Kirchneriella contorta ......................... 19 4.2.a Efeito do cobre e choque de cores de luz nos parâmetros de crescimento..........19 4.2.b Efeito do cobre e choque de luz colorida nos parâmetros fotossintéticos .......... 23 4.2.c Efeito do cobre e choque de luz na composição bioquímica ............................... 26 5. Conclusão .......................................................................................................... 32 6. Referências ........................................................................................................ 33 6 1. Introdução As microalgas exercem papel de fundamental importância nos ambientes aquáticos, pois são as principais produtoras primárias (Malapascua et al. 2014) e, portanto, mudanças na composição bioquímica, diversidade ou ainda no número populacional delas podem impactar os níveis tróficos superiores (Beauvais-flück, Slaveykova e Cosio 2019). Além de sua importância ambiental, as microalgas são promissoras em diversas áreas da biotecnologia, tanto na indústria alimentícia, como na de cosméticos. Na indústria alimentícia relaciona-se aos alimentos funcionais graças à sua capacidade de sintetizar compostos bioativos (Camacho, Macedo e Malcata 2019; Galasso et al. 2019). Na indústria de cosméticos, sua importância relaciona-se aos compostos antioxidantes que elas produzem, com propriedades anti- inflamatórias, inibição de células tumorais, entre outras (Gong e Miao 2019). Entretanto, a produção de biomoléculas por microalgas enfrenta o problema de baixo rendimento, fator que torna o produto de alto custo e pode, muitas vezes inviabilizar uma produção comercial. O cobre é um micronutriente essencial aos organismos fotossintéticos e, sendo as microalgas fotossintetizantes, elas são grandemente afetadas pelo cobre. Esse metal é requerido em concentrações adequadas em vários processos metabólicos, sendo encontrado em proteínas carreadoras de elétrons na fotossíntese e na respiração, assim como em mecanismos de reparo de estresse oxidativo (Raven et al. 1999; Georgopoulos et al. 2001; Lombardi e Maldonado 2011). Outros efeitos do cobre em microalgas, como redução da taxa de divisão celular e aumento de seu volume, foram também relatados (Silva et al. 2018). Predominantemente, em quantidades excessivas, o cobre gera um efeito negativo generalizado na microalga, podendo levar a cultura à morte (Sandmann e Boger 1980; Lombardi e Maldonado 2011; Silva et al. 2018). Tripathi e Gaur (2006) mostraram que o cobre pode ser prejudicial para o rendimento de biomoléculas, como ocorrido com Scenedesmus sp exposta a 10 µM de cobre, que também teve sua taxa de crescimento reduzida. Sabe-se que diversas situações de estresse ambiental são capazes de induzir modificações bioquímicas nas microalgas, incluindo estresse oxidativo (Pinto et al. 2003; Bossuyt e Janssen 2004; Lunka e Bayless 2013). Nesse quesito destaca-se o estresse por cobre ou outro metal, podendo levar ao aumento da produtividade de lipídios, carboidratos e/ou proteínas (Pistocchi et al. 1997; Chia et al. 2013; Silva et al. 2018; Baracho et al. 2019). Mas estressar microalgas resulta, na maioria das vezes, em concomitante redução da taxa de 7 crescimento (Chia et al. 2013; 2017). Portanto, sob estresse, biomoléculas são acumuladas em detrimento da geração de biomassa. Percebemos que induzir um estresse algal para obter aumento de biomoléculas sem alterar a taxa de crescimento, ou mesmo causando-lhe um estímulo pode ser tarefa complexa e exigir estratégia adequada. O efeito hormese, descreve um fenômeno no qual compostos tóxicos em baixa dose podem ocasionar estímulo mas em alta dose, toxicidade/letalidade. Baracho et al. (2019) mostrou que Chlorolobium braunii exposta ao cobre em concentrações próximas às ambientais, ou seja, da ordem de 10-8 mol L-1 aumentou a produtividade de algumas biomoléculas sem no entanto apresentar efeito negativo na taxa de crescimento. Silva et al. (2018) obteve resultado similar investigando os efeitos do cobre em Scenedesmus quadricauda. A exposição de microalgas à mais de um fator de estresse também pode ser considerada. Apesar de existir pouca informação na literatura, exposição de microalgas à combinação de estresses pode ser promissor. Efeitos sinérgicos podem ser observados, como em Chia et al. (2013; 2017). Investigando a produção de biomoléculas em sistemas de cultivo semi-contínuos, Chia et al (2013; 2017) expôs a microalga Chlorella vulgaris que havia sido aclimatada em distintas concentrações dos nutrientes nitrogênio e fósforo, à diferentes concentrações de cádmio. Os autores mostraram grande magnificação no acúmulo de lipídios, aumentando em cerca de 30x os triacilglicerois. Diodos emissores de luz (LEDs) têm sido usados para o cultivo e produção de microalgas (Blanken et al. 2013; Olle e Virisile 2013) e podem ser aplicados para induzir modificações na composição bioquímica de sua biomassa (Zhao et al. 2013), uma vez que cores diferentes podem ser usadas. Diferentemente de um estresse químico pela limitação de nutrientes que precisa ter as células aclimatadas (Voltolina et al. 1998), no estresse físico não há a necessidade de aclimatação prévia, sendo isso um facilitador do processo de manipulação. Segundo Keeling (2013), as microalgas têm preferência para crescer sob a luz vermelha (660 nm) ou azul (420-470 nm), sendo que em geral a vermelha resulta em altas taxas de crescimento e células menores pois aceleram o ciclo celular (Blanken et al. 2013), enquanto a luz azul influencia a expressão gênica e vias metabólicas (Ruyters 1984). Assim, LEDs coloridos como indutores da biossíntese de compostos em microalgas podem ser uma ferramenta promissora na manipulação bioquímica e de fácil interação com estresse químico como o cobre. Mas como induzir um efeito hormese com o cobre (estresse químico) simultaneamente a um estresse físico (LEDs de cores diferentes) objetivando o acúmulo de biomoléculas sem redução da taxa de crescimento e, consequentemente obter aumento líquido de produtividade 8 da biomolécula em microalgas? Uma resposta pode ser o emprego de concentração do metal tão baixa que rotas metabólicas possam ser levemente modificadas, mas processos importantes como a divisão celular, não. Nesta pesquisa testamos essa hipótese utilizando uma combinação de situações: estresse químico (cobre) e exposição à LEDs nas cores azul e vermelha em intensidade PAR similar à do cultivo em luz branca. Nosso objetivo foi induzir modificação bioquímica intracelular em Kirchneriella contorta, microalga Chlorophyta de água doce. Cuidadosamente planejada e previamente definida, a concentração de cobre não ocasionou alteração na taxa de crescimento, mas possivelmente um estresse oxidativo de baixa magnitude, comparável a um efeito hormese. Em sinergia com LED azul, a produção de biomoléculas aumentou quase 30% na presença de 3,8x10-9 mol L-1 de cobre livre. 2. Objetivo Geral O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do cobre, em diferentes concentrações ambientais, isolado e em combinação com exposição à diferentes cores de LED (azul e vermelho), na microalga Kirchneriella contorta investigando fatores fotossintéticos, de crescimento celular e produção de biomoléculas. 2.1 Objetivos específicos • Analisar as respostas da microalga Kirchneriella contorta em relação ao crescimento, concentração de clorofila a e b e densidade populacional em diferentes concentrações de íons de cobre e sob duas qualidades de luz (LED vermelho e LED azul); • Determinar os efeitos do cobre e da exposição aos LED vermelho e azul nos parâmetros fotossintéticos; • Buscar concentrações de cobre que não interfiram significativamente na taxa de crescimento, mas que aumentem a produtividade específica de pigmentos, proteínas, carboidratos e carotenoides em Kirchneriella contorta. • Expor a microalga à concentração ótima de cobre às diferentes cores de LED e analisar a produtividade específica de pigmentos, proteínas, carboidratos e carotenoides em Kirchneriella contorta. 9 3. Material e métodos Um fluxograma da organização experimental deste projeto é apresentado na figura 1. Nele, mostramos as duas etapas metodológicas e as análises que foram realizadas. Figura 1. Fluxograma do desenvolvimento e etapas laboratoriais deste projeto. a) Condições de cultivo A microalga Kirchneriella contorta foi cultivada em meio WC com pH ajustado para 7.0 (Guillard & Lorenzen 1972), autoclavado (20 min, 121 °C, 1 bar; AV Phoenix Luferco, Brasil) e mantida sob condições controladas de temperatura (24 ± 1°C) e intensidade luminosa (radiação fotossinteticamente ativa, PAR) de ~ 200 µmol photons m-2 s-1 e com fotoperíodo 12:12 h (claro:escuro) para todas as cores de LED (branco – controle, azul e vermelho). b) Varredura de concentrações de cobre em microplacas e seus efeitos no crescimento 10 Realizamos estudo prévio (teste de varredura do cobre) com duração de 120 h para definição da amplitude de concentrações de cobre a ser usada nos ensaios de manipulação bioquímica. O teste de varredura foi feito com 30 concentrações de cobre nominais e a microalga exposta ao metal foi cultivada em microplacas com 96 poços. Essa etapa foi importante para a prospecção das concentrações de cobre, pois permitiu o acompanhamento do crescimento em 30 concentrações de cobre em apenas uma etapa (120 h). Durante o processo alguns cuidados foram necessários. Para que não houvesse contaminação da cultura uma cobertura com parafilme (Parafilm®, Bemis, U.S.A.) foi adicionada, protegendo a cultura da exposição ao ambiente, mas permitindo troca gasosa. Além disso, a intensidade luminosa incidente foi controlado, pois em estudos prévios percebeu-se que altas intensidades resultavam em elevada evaporação, podendo interferir na concentração da cultura. O controle constou do meio de cultura W.C. com a concentração de cobre 4x10-8 mol L-1. Para esse teste, 30 cultivos de 100 mL (inóculo 104 células mL-1) foram feitos em frascos de cultura de tecido de poliestireno. Esses cultivos foram expostos a concentrações nominais de cobre entre 3x10-8 a 9x10-4 mol L-1 e deles, uma alíquota de 300 µL foi transferida para poços de uma microplaca (em triplicata). Essa microplaca foi incubada sob condições controladas de luz e temperatura. O cultivo nos poços da microplaca teve duração de 120 horas e durante esse período foi monitorado diariamente o crescimento celular por meio da absorbância 684 nm, 570 nm e 750 nm. Para essas determinações utilizamos um espectrofotômetro leitor de placas (Epoch™ Microplate Spectrophotometer, U.S.A.). O cobre foi adicionado 24 h antes do início dos experimentos e o cobre livre (Cu2+) determinado imediatamente antes de inocular as células. Uma solução padrão de cobre (AAS/ICP, 1000 mg L-1, 38996 Sigma-Aldrich, EUA) foi utilizada para a confecção de padrões, que diluídos foram usados nas culturas. As concentrações efetivas EC10, EC20 e EC50 foram calculadas a partir dos dados obtidos e com o auxílio do program Graph Pad Prism 6. Para a composição bioquímica (2º etapa), definimos as concentrações de cobre que pouco afetaram as taxas de crescimento, permitindo conciliar o fator de estresse para a manipulação bioquímica e culturas que produzam uma quantidade de biomassa próxima ao controle, buscando-se assim um ganho no rendimento de biomoléculas. c) Manipulação bioquímica usando-se estresse químico (cobre) e físico (LEDs azul e vermelho) e seus efeitos no crescimento, fotossíntese e composição bioquímica 11 O experimento de manipulação bioquímica foi realizado em frascos de cultura de tecido de poliestireno com capacidade de 1000 mL e volume de 900 mL de cultura, mantidos verticalmente e borbulhados com ar filtrado (0,22 µm; Chromafil Xtra PUDF 20/25, Alemanha). A adição do cobre seguiu o mesmo padrão descrito para o teste de varredura de concentrações (Material e Métodos, item b). O inóculo inicial foi de 5x104 células mL-1 a partir de uma cultura em crescimento exponencial e rendimento quântico máximo ~ 0.70. O experimento teve duração de 96 h. Diariamente, determinações relativas ao crescimento populacional (contagem de células) e fotossíntese (rendimento quântico máximo) foram realizadas. Em 48 h de cultivo (fase exponencial de crescimento), foram feitas determinações bioquímicas na biomassa (carboidratos, proteínas, carotenoides e concentração de clorofila a e b). Imediatamente após amostragem em 48 h, cada uma das três réplicas dos tratamentos com cobre deram origem a 3 culturas que seriam expostas a cada cor de LED (branco, azul e vermelho), como mostrado na figura 2. Desse modo, três réplicas de cada tratamento nas 3 cores de LED foram obtidas. Após 48 h de exposição às LEDs coloridas, as culturas foram amostradas para as mesmas determinações bioquímicas, correspondendo, portanto, à 96 h de tempo experimental total. Para aferirmos os comprimentos de onda dos LEDs comerciais que foram usados, os espectros de emissão (figura 3) de cada cor foram registrados com um radiômetero Ocean Optics modelo UBS 2000 equipado com fibra óptica BIF-600-UV-VIS e software de coleta OIBase32 (Dunedin, FL). 12 d) Determinação dos íons cobre livre (Cu2+) A determinação de cobre livre 24 h após sua adição no meio WC foi feita de acordo com o procedimento descrito em Lombardi et al. (2007), em rotina no laboratório onde foi desenvolvido este projeto. Essa metodologia é baseada em um eletrodo seletivo de íons cobre (ISE-Cu) com calibração feita através do uso de tampões metálicos. Utiliza-se um eletrodo seletivo de cobre (ISE-Cu) como eletrodo de trabalho (Thermo Scientific Orion 9429BN) e um eletrodo de referência de junção dupla (Thermo Scientific Orion 900200, fluxo seguro D/J) sob temperatura controlada de 25 ± 1 oC. O tampão metálico (cobre) foi composto por borato de sódio (Sigma- Aldrich, Alemanha), nitrato de sódio (Sigma-Aldrich, Alemanha), padrão de cobre (38996 Sigma-Aldrich, EUA) e ácido nitrilotriacético (Sigma-Aldrich, Alemanha). Em geral, os tampões metálicos são capazes de estender os limites de detecção do sistema ISE-Cu para 10-13 - 10-10 mol L-1. A curva de calibração para o sistema ISE-Cu é sempre realizada em pH 5 e foi feita a partir da diluição serial de um padrão comercial mono-elementar AAS/ICP de cobre (1000 mg L-1) (38996 Sigma-Aldrich, EUA). 13 As concentrações de cobre livre determinadas para o teste feito nas microplacas são mostradas na Tabela 1. Na Tabela 2 mostramos os valores usados para o experimento de manipulação bioquímica. e) Parâmetros de crescimento Diariamente foram coletados 4 mL de amostra para monitoramento da cultura e determinação do padrão de crescimento. As células foram contadas em um citômetro de fluxo MUSE (Millipore, USA) e em microscópio óptico (Nikon Eclipse E200, Japão) a fim de acompanhar visualmente a cultura e verificar eventual alteração de volume celular, além de qualquer contaminação. A taxa de crescimento (d-1) foi determinada, a partir dos resultados do MUSE, por meio de uma regressão linear, utilizando-se o logaritmo natural da densidade celular (célula mL-1) versus o tempo experimental (dias), sendo que a inclinação da reta formada representa a taxa de crescimento específica na fase exponencial da cultura. A determinação dos valores de EC10, EC20 e EC50 teve como base o número de células por mL e também a taxa de crescimento dos cultivos. f) Parâmetros fotossintéticos Utilizando-se um fluorímetro com pulsos de luz de amplitude modulada (Phytoplankton Analyzer, PHYTO-PAM, Heinz Walz, Alemanha) o rendimento quântico máximo (M) foi monitorado diariamente. Para isso, as amostras foram aclimatadas no escuro por 20 minutos, obtendo-se oxidação completa do fotossistema II (PSll). Esse parâmetro resulta da diferença entre a fluorescência máxima e mínima dividida pela fluorescência máxima, como mostrado na equação (1), após a alga ser aclimatada no escuro. Os detalhes da metodologia podem ser encontrados em Lombardi e Maldonado (2011). M = (FM– F0) / FM (1) Em 48 h e 96 h foram determinados os valores de rendimento quântico efetivo (´M), a dissipação fotoquímica (qP) e não fotoquímica (NPQ) por meio de pulsos de luz em amostra exposta à luz de intensidade similar ao cultivo (200 µmol fotóns m-2 s-1) a cada 20 s por 10 min corridos. A partir desses pulsos foram obtidos os valores de fluorescência em estado estável (F’S), o qual possibilitou determinar o valor de fluorescência em células adaptadas à luz (F’M) e por fim o rendimento quântico efetivo (Փ´M), quenchings fotoquímicos (qP) e o NPQ foram estimados por meio das equações representadas abaixo (Juneau, Berdey, and Popovic 2002). 14 ´M = (F’M– F’S) / F’M (2) qP = (F’M – F’S) / (F’M– F’0) (3) NPQ = [FM – F’M] / F’M (4) g) Determinações bioquímicas Ao fim das 48 h e 96 h de cultivo foram determinados carboidratos intracelulares totais. Para isso, amostras da cultura para carboidratos (30 mL) foram centrifugadas em uma centrífuga refrigerada (Thermo Scientific, Sorvall Legend XTR, EUA) por 20 min e em 4400 rpm. Os pellets formados foram armazenados em -22 °C para posterior análise. A determinação de carboidratos totais seguiu metodologia descrita em Albalasmeh et al (2013). A quantificação de proteínas totais foi realizada pelo método de Slocombe (2013) modificado. As concentrações de clorofila a, b e carotenoides foram determinadas de acordo com Wellburn (1994). h) Análise estatística As análises estatísticas dos resultados da seleção da amplitude de concentração de cobre (30 concentrações) foram baseadas em comportamento dos pontos amostrais com ajustes do gráfico de absorbância vs concentração de cobre. O software Minitab (versão 17 para Windows) foi usado para comparação das concentrações de carboidratos, proteínas, carotenoides e de clorofila a e b (variáveis discretas) através de ANOVA One Way em 48 h, pois a única variável era o cobre, Two Way em 96 h, com variáveis sendo cobre e luz, e Teste de Tukey. As representações gráficas foram feitas utilizando-se o programa IgorPro 6.0.5 (WaveMetrics, EUA). 4. Resultados e discussão 4.1 Varredura das concentrações de cobre em microplaca As taxas de crescimento (tabela 1) e as curvas de crescimento (figura 4) para as 30 concentrações de cobre testadas nas microplacas são apresentadas para a absorbância em 684 nm. As absorbâncias de 570 nm e 750 nm não foram apresentadas, porém seguiram o mesmo comportamento das curvas de 684 nm. A partir desses resultados observamos que o cobre teve papel importante no crescimento da microalga. Sabe-se que o cobre é um micronutriente essencial para as microalgas, participando de funções essenciais do metabolismo, como no transporte de elétrons da fotossíntese e como cofator enzimático em reações biológicas (Fabisiak et al. 1999; Raven et 15 al. 1999; Reynolds 2006). Obteve-se que com o aumento da concentração de cobre houve redução do crescimento de K. contorta, chegando à ausência de crescimento nas concentrações mais elevadas (figura 4c). Essa resposta se deve ao efeito inibitório do cobre em altas concentrações. Esse comportamento está de acordo com os trabalhos encontrados na literatura, como Bossuyt e Janssen (2004), Levy, Stauber e Jolley (2007), Debelius et al. (2009), Lombardi e Maldonado (2011), de Abreu et al. (2014), Baracho et al. (2019). 16 Tabela 1. Concentrações de cobre adicionado e taxas de crescimento para Kirchneriella contorta obtidas após exposição ao metal. Tratamento Cobre Adicionado Taxa crescimento 1- controle 4.0x10-8 0.606 2 6.0x10-8 0.559 3 9.0x10-8 0.514 4 1.2x10-7 0.493 5 1.5x10-7 0.542 6 3.0x10-7 0.518 7 6.0x10-7 0.598 8 9.0x10-7 0.519 9 1.2x10-6 0.543 10 1.5x10-6 0.583 11 3.0x10-6 0.470 12 4.5x10-6 0.542 13 6.0x10-6 0.512 14 7.5x10-6 0.511 15 9.0x10-6 0.411 16 1.0x10-5 0.193 17 1.2x10-5 0.282 18 1.3x10-5 0.294 19 1.5x10-5 - 20 3.0x10-5 - 21 4.5x10-5 - 22 6.0x10-5 - 23 9.0x10-5 - 24 1.0x10-4 - 25 1.2x10-4 - 26 1.5x10-4 - 27 3.0x10-4 - 28 4.5x10-4 - 29 6.0x10-4 - 30 9.0x10-4 - 17 A influência do cobre no crescimento de microalgas ocorre devido à sua participação em processos metabólicos vitais para esses organismos (Lombardi e Maldonado 2011). As microalgas realizam fotossíntese para sintetizar metabólitos necessários para o seu crescimento e reprodução (Malapascua et al. 2014). O cobre tem papel importante no processo fotossintético, participando, por exemplo, da estrutura de enzimas do fotossistema (Horváth et 18 al. 1998). Porém, em excesso o cobre pode interferir nas rotas metabólicas das microalgas e gerar espécies reativas de oxigênio (Tripathi e Gaur 2006). Isso pode levar à degradação de membranas das microalgas interferindo assim na divisão celular (Sekiguchi et al. 2005). Em nosso estudo essa etapa da prospecção do cobre suportável à célula é importante, pois a concentração ideal ou deletéria para as microalgas depende da espécie utilizada. O trabalho realizado por Levy et al. (2008) com a microalga Phaeodactylum tricornutum mostrou que o EC50 para essa espécie foi de 1,2x 10-7 mol L-1 de cobre. Já os resultados de Sabatini et al. (2009) mostraram que a concentração de 2,1x10-4 mol L-1 era fatal para a Chlorella kessleri. Assim, estudos que entendam o efeito de diferentes concentrações de cobre em espécies não estudadas de microalgas são de grande relevância fisiológica e ambiental. Na tabela 1 mostramos as concentrações de cobre que foram testadas na microalga K. contorta. A partir do programa Graph Pad Prism 6 os valores de EC 10, EC 20 e EC 50 foram calculados para a espécie K. contorta. Os valores obtidos foram EC10 4,66x10-6, EC20 5,78x10- 6 e EC50 8,38x10-6 mol L-1. As concentrações selecionadas para o experimento de manipulação bioquímica são mostradas na Tabela 2 (controle 3x10-8, 1x10-7, 1x10-6, 3x10-6 e 6x10-6 mol L- 1). As seis concentrações de cobre selecionadas foram abaixo do valor de EC20, a fim de manter-se as culturas saudáveis para a etapa seguinte. Tabela 2. Cobre adicionado ao meio WC 24 horas antes da inoculação das células (cobre nominal) e concentrações de íons de cobre livre (mol L-1) determinados por ISE-Cu. *Tratamento controle. Nominal Livre log [Cu2+] mol.L-1 *4x10-8 *1,6x10-9 *-8.8 3x10-8 2,2x10-9 -8.6 1x10-7 3,8x10-9 -8.4 1x10-6 1,4x10-8 -7.9 3x10-6 1,7x10-8 -7.8 6x10-6 9,6x10-8 -7.0 4.2 Manipulação bioquímica e fisiológica da Kirchneriella contorta 19 Nessa etapa foi realizada a manipulação bioquímica com o metal e diferentes cores de LEDs. Abaixo estão apresentados os resultados obtidos para as 6 concentrações trabalhadas. 4.2.a Efeito do cobre e choque de cores de luz nos parâmetros de crescimento A taxa de crescimento, biomassa seca e biovolume nas primeiras 48 h para K. contorta (luz branca) estão representadas na figura 5. Como esperado e de acordo com o tratamento preliminar, os parâmetros de crescimento em 48 h não apresentaram diferenças estatísticas entre as concentrações de cobre. Provavelmente para K. contorta as concentrações trabalhadas estão dentro das toleradas fisiologicamente. Neste estudo, as concentrações de cobre livre estão dentro da ordem de 10-9 20 e 10-8 mol L-1. Essas concentrações são passíveis de serem encontradas nos ambientes aquáticos naturais (Davies e Bennett 1985) e provavelmente por isso, a microalga foi capaz de responder bem a essas variações. O crescimento em exposição a diferentes qualidades de luz é alvo de diversos estudos (Yan et al. 2013; Hultberg et al. 2014; Atta et al. 2013; Rebolledo-Oyarce et al. 2019), tendo apresentado respostas diferentes entre as espécies (Teo et al. 2014). A figura 6 mostra as taxas de crescimento, biomassa seca e biovolume ao final da exposição dos LEDs nas cores azul e vermelho (96 h). Analisando o efeito das luzes dentro de cada concentração de cobre observa- se que a luz azul promoveu aumento da taxa de crescimento no controle e na maior concentração de Cu2+ (9,7x10-8 mol L-1) e da biomassa na concentração de Cu2+ de 3,8x10-9 mol L-1. Além disso, nas duas maiores concentrações de cobre livre, a luz vermelha resultou em maior biomassa final quando comparada com a luz branca e azul. Durante as 48 horas de exposição aos LEDs coloridos, a maior taxa de crescimento (~ 0,6 d-1) e de biomassa (~ 70 mg L-1) foi obtida na concentraçãode Cu2+ de 3,8x10-9 mol L-1 em exposição à luz azul. Esses resultados estão de acordo com diversos trabalhos que analisam os efeitos de diferentes cores de luz no crescimento de microalgas (Teo et al. 2014; Rebolledo-Oyarce et al. 2019). De acordo com Teo et al. (2014) as microalgas Nannochloropsis sp. e Tetraselmis sp. foram expostas a luz azul, vermelha, azul-vermelha e branca e apresentaram maiores taxas de crescimento na luz azul. Segundo a literatura, o LED azul permite uma maior penetração através da cultura (Vadiveloo et al. 2015; Schulze et al. 2016), melhorando a divisão celular e as taxas de crescimento das microalgas (Teo et al. 2014). Além disso, segundo Ruyters (1984), a luz azul consegue afetar um grande número de enzimas, sendo elas fotossintéticas e participantes de processos importantes, como a síntese de pigmentos e a fotorrespiração. Outro ponto de atenção que pode justificar as maiores taxas de crescimento sob exposição à luz azul é o estudado por Schulze et al. (2016). Esses autores observaram maiores taxas de absorção de nutrientes em exposição à luzes coloridas, entre elas vermelha e azul, sendo a absorção maior sob luz azul. Essa observação pode justificar as maiores taxas de crescimento quando K. contorta foi exposta ao comprimento de onda de 445 nm nas menores concentrações e 652 nm nas duas maiores concentrações de Cu2+. Além da luz azul, alguns trabalhos pontuam o efeito positivo da luz vermelha no crescimento do fitoplâncton (Wang et al. 2007; Abiusi et al. 2014; Han et al. 2019). Em exposição a luz vermelha Spirulina platensis apresentou um aumento na biomassa final (Wang et al. 2007) e Tetraselmis suecica um aumento de 2,5 vezes na concentração celular (Abiusi et 21 al. 2014) em relação ao controle. Segundo os autores, a luz vermelha permite uma melhor absorção da clorofila (Wang et al. 2007). Vale pontuar que o efeito da qualidade da luz no crescimento é dependente da espécie avaliada e relacionado aos diferentes conteúdos de pigmentos e fotorreceptores presentes em suas respectivas composições (Abiusi et al. 2014). A qualidade da luz pode afetar o ciclo celular das microalgas resultando em mudanças morfológicas (Schulze et al. 2016). No nosso estudo, os menores valores de biovolume ocorreram em exposição à luz azul, concomitantemente aos maiores valores de taxas de crescimento (figura 2c). Estudando a morfologia celular em resposta à variação no espectro de luz, Schulze et al. (2016) observaram em ordem decrescente de área de superfície celular os tratamentos com luz branca, seguido por vermelho e azul para Nannochloropsis oculata e azul, vermelho e branco para Tetraselmis chuii. A mesma variação de acordo com a espécie foi observada por Aidar et al. (1994). Esses autores obtiveram maiores volumes celulares para 22 Tetraselmis gracilis em exposição à luz vermelha em comparação com a luz azul, e o inverso para Cyclotella caspia. Em relação aos dados de viabilidade (não mostrados) as mesmas se mantiveram acima de 95%, tanto em 48 h quanto em 96 h. Esse comportamento era esperado, já que a amplitude da concentração de cobre usada foi cuidadosamente escolhida para não afetar o crescimento populacional. 4.2.b Efeito do cobre e choque de luz colorida nos parâmetros fotossintéticos Nas figuras 7 e 8 estão mostrados os rendimentos quânticos e quenchings para K. contorta, no tempo de exposição de 48 h e 96 h, respectivamente. 23 Os rendimentos fotossintéticos e quenchings fotoquímicos em 48 h não apresentaram diferenças significativas com o aumento da concentração de cobre. O quenching não fotoquímico (NPQ) apresentou aumento significativo (~ 30%) a partir da concentração de Cu2+ de 1,40x10-8 mol L-1. O aumento gradual do quenching não fotoquímico dissipado na forma de calor (NPQ) reflete alterações do aparato fotossintético. Resultado similar foi observado por Baracho et al. (2019), mas em concentrações de cobre mais elevadas. Esses autores observaram aumento de aproximadamente 81% da dissipação não fotoquímica na microalga Chlorolobion braunii em concentrações de cobre livre de ~ 5,0x10-6 mol L-1. Esses resultados também estão de acordo com os encontrados por Echeveste et al. (2017) e Silva et al. (2018). As respostas fotossintéticas das microalgas refletem a saúde do cultivo. O aumento do cobre disponível resulta em um estresse oxidativo (Tripathi e Gaur 2006), afetando a transferência de prótons durante a fotossíntese (Dewez et al. 2005). Sabe-se que o aumento de NPQ é uma resposta da microalga aos estresses promovidos por mudanças ambientais, como variações das concentrações de nutrientes ou excesso de luz (López-Climent et al. 2008; Andersson et al. 2006; Ihnken et al. 2010). Essa resposta fotossintética da microalga evita o fluxo excessivo de elétrons para o PSI, diminuindo o risco de fotoinibição (Sonoike 2011). 24 Os rendimentos fotossintéticos e os quenchings fotoquímico não apresentaram diferenças significativas em função do choque de luz entre os tratamentos com cobre. Entretanto, dentro de cada concentração de cobre, o valor de NPQ aumentou em relação ao branco quando K. contorta foi exposta ao LED azul (2,4x maior) e vermelho (2x maior), com exceção das duas maiores concentrações. Segundo Das et al. (2011), a eficiência fotossintética no uso da energia luminosa é dependente do comprimento de onda recebido. Em nosso estudo, até a concentração de cobre livre de 1,4x10-8 mol L-1, os cultivos expostos à luz azul e vermelha apresentaram maiores NPQs que em LED branco. Isso sugere que até essas concentrações, o aumento de NPQ foi causado pela qualidade da luz. Sabe-se que as microalgas se adaptam ao meio circundante e isso reflete na sua fisiologia. Estudos indicam 25 que a fotossíntese pode ser beneficiada ou prejudicada pela qualidade da luz de maneira diferente entre as espécies algais (Mercado et al. 2004). Assim, as respostas fotossintéticas às diferentes qualidade de LEDs são dependentes das espécies estudadas. Os altos valores de NPQ em exposição à luz azul podem ser decorrentes da alta energia desse comprimento de onda, carregada pelos fótons e que finalmente atingem as algas (Kommareddy et al. 2003; Fu et al. 2012). É sabido que os fótons de comprimentos de ondas curtos, entre eles o azul (~ 460 nm), apresentam uma maior probabilidade de atingir o complexo de coleta de luz (Yan et al. 2013). Sendo assim, o fóton azul, por ser mais energético, pode resultar em um aumento de NPQ, em situações adversas, como mecanismo de defesa do aparato fotossintético (Matthijs et al. 1996; Baer et al. 2016). Essas observações vão de encontro ao descrito no trabalho de Mercado et al. (2004), que estudaram o efeito da luz azul na taxa fotossintética máxima (Pmax) e na irradiância de saturação de luz (Ek) de cinco espécies de diatomáceas. Das cinco espécies, quatro apresentaram redução de Pmax e todas apresentaram redução de Ek na presença da luz azul. Assim, o aumento de NPQ é uma resposta da microalga frente à alta energia dessa luz (azul), funcionando como um mecanismo de proteção da fotoinibição (Das et al. 2011; Yan et al. 2013). Destacamos que na interação com o cobre nas duas maiores concentrações, as três cores de luz apresentaram valores semelhantes de NPQ. Sabe-se que o aumento do cobre pode resultar em danos oxidativos nas microalgas, devido à formação de espécies reativas de oxigênio (Pinto et al. 2003). Assim, sugerimos que nessas maiores concentrações, o aumento de NPQ possa ser uma resposta da microalga K. contorta ao sinergismo entre cobre e LED colorido. 4.2.c Efeito do cobre e choque de luz na composição bioquímica A produtividade específica de pigmentos em 48 h em função da concentração de cobre está apresentada na figura 9. 26 Para as clorofilas a e b, maiores produtividades foram encontradas em concentrações intermediárias de cobre (Chl a: ~ 0,52; Chl b: 0,40 ug mL-1 d-1). Carotenoide não apresentou diferença estatística com o aumento do cobre no meio de cultura. O cobre é um micronutriente importante para os processos metabólicos das microalgas sendo requerido em quantidades adequadas (Lombardi e Maldonado 2011; Raven et al. 1999). Em nosso estudo, o aumento do cobre em concentrações até 1,75x10-8 mol L-1 de Cu2+ promoveu um aumento da produtividade específica de Chl a e b. O mesmo aumento do teor de clorofila foi encontrado para Pseudokirchneriella subcapitata (Bossuyt e Janssen 2004) e para Phaeodactylum tricornutum (Cid et al. 1995) em concentrações de 1,6x10-6 mol L-1 de cobre total. 27 Em contrapartida, na maior concentração de cobre houve uma redução na produtividade de clorofila a e b. Esse resultado é corroborado pelo trabalho de Tripathi e Gaur (2006) que obtiveram redução do teor de clorofila a e b em Scenedesmus sp. em concentrações elevadas de cobre. Em concentrações de 3,9x10-7 mol L-1 de cobre total Pseudokirchneriella subcapitata também apresentou um ganho no teor de Chl a, entretanto com o aumento para concentrações de 7,9x10-7 mol L-1 ocorreu uma redução desse pigmento (Soto et al. 2011). No estudo de Purbonegoro et al. (2018) a concentração de 1,5x10-6 mol L-1 de cobre reduziu a quantidade de clorofila a produzida por Pavlova sp. Casos assim confirmam que em altas concentrações o cobre deixa de ser um micronutriente benéfico e passa a ser tóxico (Tripathi e Gaur 2006). Assim, é importante trabalhar dentro de concentrações adequadas de cobre. Em nosso trabalho não houve diferença na produtividade específica de carotenoides (48 h) entre os tratamentos de cobre. Diferente do encontrado neste estudo, em Pseudokirchneriella subcapitata o aumento de cobre (1,6x10-6 mol L-1) resultou em um aumento de 6.7x de carotenoides (Bossuyt e Janssen 2004). No trabalho de Mallick (2004) as concentrações de cobre estimularam um aumento na síntese de carotenoides até a concentração de 4,7x10-5 mol L-1 para a microalga Chlorella vulgaris A produtividade das clorofilas a e b após a exposição por 48 h aos LEDs coloridos foram as menores a partir das concentrações de cobre de Cu2+ de 1,4x10-8 mol L-1. Quanto aos carotenoides a concentração de 3,8x10-9 mol L-1 de Cu2+ resultou no maior valor de produtividade específica independente da cor do LED quando comparada ao controle. Mas, a maior produtividade (50% maior em comparação ao tratamento com luz branca e cobre controle) de carotenoides foi obtida mediante interação sinérgica com cobre em concentração 3,8x10-9 mol L-1 e luz azul, como pode ser visto na figura 10C. 28 Segundo literatura, as microalgas apresentam variação da composição de seus fotorreceptores, a qual é crucial para adaptação à variação natural da luz no ambiente (Chory et al. 2010; Shu et al. 2012). Há estudos que relatam diferenças no teor de pigmentos em resposta à exposição a diferentes qualidades de luz (Chen et al. 2010; Rebolledo-Oyarce et al. 2019). Para K. contorta o LED vermelho resultou em ganho na produtividade específica de Chl a e b no controle. Diferente deste estudo, em exposição ao LED azul a microalga Tetraselmis suecica obteve maiores rendimentos Chl a e b (Abiusi et al. 2014) e menores em luz vermelha. Esse aumento no teor de clorofila em exposição à luz azul também foi observado para Nannochloropsis sp (Vadiveloo et al. 2015), Spirulina platensis (Chen et al. 2010) e em 29 Dunaliella tertiolecta um aumento de ~14% (Rebolledo-Oyarce et al. 2019), todos em relação a luz branca. Neste estudo, mostramos que ocorreu um efeito sinérgico entre o cobre (~ 4x10-9 mol L-1 Cu2+ livre) e a luz azul resultando em ganho de 22% a mais do que o controle na produtividade de carotenoides, como mostrado na figura 10. Trabalhos da literatura corroboram o efeito das diferentes cores de luz na produção de carotenoides (Lamers et al. 2008; Abiusi et al. 2014; Han et al. 2019). Entretanto o efeito parece ser dependente da espécie e cepa estudadas. Assim como neste estudo, a microalga Haematococcus pluvialis apresentou maior rendimento de carotenoide em exposição a luz azul (Suyono et al. 2015). Já no trabalho de Han et al. (2019), que também investigou H. pluvialis, a luz vermelha aumentou a produção de carotenoides em ~13%. Fu et al. (2013) combinaram luz vermelha e azul e relataram maior biossíntese de carotenóides (2,3x) em Dunaliella salina. As produtividades específicas de carboidratos e proteínas estão mostradas nas figuras 11 e 12, em 48 e 96 h, respectivamente. 30 Assim como os pigmentos fotossintéticos, a produtividade de carboidratos em 48 h foi maior nas concentrações de cobre intermediárias (3,8x10-9 e 1,4x10-8 mol L-1). Em comparação com o controle, houve um aumento de carboidratos de 80% em 3,8x10-9 mol L-1 e de 47% em 1.4x10-8 mol L-1. A produtividade de proteínas também aumentou em células expostas à 3,8x10- 9 mol L-1 de cobre livre, sendo 30% maior do que no controle. As mudanças que ocorrem na fisiologia das microalgas frente à exposição ao cobre (e outros metais) são consideradas mecanismos de defesa e incluem a produção de ligantes metálicos, diminuindo a biodisponibilidade (Pistocchi et al. 1997; Cobbett e Goldsbrough 2002). Silva et al. (2018) mostrou que em concentrações de cobre 1x10-6 mol L-1 de cobre nominal Scenedesmus quadricauda apresentou aumento da biossíntese de proteínas e carboidratos, mas em concentrações mais elevadas a literatura mostra que o efeito inibitório resulta em redução das biomoléculas (Tripathi e Gaur 2006). Considerando o efeito do cobre em diferentes cores de luz, mostramos que em geral, tanto o vermelho como o azul induziram ao aumento da produtividade de carboidratos. Aqui novamente observamos que sob luz azul e 3,8x10-9 mol L-1 Cu2+ livre a maior produtividade de 31 carboidratos (~ 9 μg mL-1 d-1) foi obtida, representando 51% a mais que no controle. Na concentração de cobre controle, e exposição à luz azul e vermelha ~7 μg mL-1 d-1 de carboidratos foi obtida. A literatura mostra que o efeito da qualidade de luz no teor de carboidratos em microalgas pode ser bastante variável. Por exemplo, em exposição à luz azul e vermelha a microalga N. oculata apresentou maior rendimento de carboidratos enquanto T. chuii foi somente sob luz vermelha (Schulze et al. 2016). Já, nenhum efeito foi observado em Nannochloropsis sp (Vadiveloo et al. 2015), mas Tetraselmis suecica apresentou redução de carboidratos sob luz vermelha quando comparadas com luz branca e azul (Abiusi et al. 2014). Podemos racionalizar que essas diferenças podem ser devidas, pelo menos em parte, às adaptações e história evolutiva das espécies. Em estudos de combinação de tratamentos de qualidade de luz, mas com os nutrientes nitrogênio e fósforo, Li et al. (2019) observaram que em privação dos nutrientes o teor de carboidratos em Chlorella sp variou conforme o dia de amostragem. Segundo os autores, essas variações ocorriam em respostas a variação de energia fornecidas pelas diferentes luzes. Para a luz azul, o maior rendimento de carboidratos foi obtido em 72 h e em condição repleta de nutrientes Quanto às proteínas, novamente 3,8x10-9 mol L-1 de Cu2+ livre estimulou a produtividade de proteínas nas três cores de luz, alcançando valor máximo de ~12 μg mL-1 d-1 na luz azul. Mas, o efeito dos LEDs coloridos variou de acordo com a concentração de cobre livre no cultivo e com a cor da luz. No controle houve aumento de ~ 41% e em 2,2x10-9 mol L- 1 de ~ 30% na produtividade de proteínas sob luz vermelha em comparação com a luz branca. Esse ganho no rendimento é maior do que o encontrado por Abiusi et al. (2014), que observaram que a luz vermelha promoveu um aumento de 5% de proteínas na microalga Tetraselmis suecica. Resultado semelhante foi observado para Spirulina sp onde houve um aumento de ~ 80% em luz vermelha (da Fontoura Prates et al. 2020). Já em Nannochloropsis sp. as diferentes cores não resultaram em diferenças no teor de proteínas (Vadiveloo et al. 2015). O fato por nós observado, de que as maiores produtividades de proteínas deram-se em luz vermelha e as maiores taxas de crescimento em luz azul pode sugerir mecanismos diferentes de acúmulo da biomolécula e não necessariamente as proteínas produzidas sob luz vermelha sejam estruturais. Isso seria esperado se maiores teores de proteínas tivessem sido observados sob luz azul. De fato, em seu trabalho, Korbee et al. (2005) observaram maiores taxas de crescimento e de rendimento de proteínas estruturais na alga Porphyra leucosticta em exposição à luz azul. Como pontuado anteriormente, considerando as microalgas fototróficas, os diversos grupos estão 32 adaptados diferentemente à variação da luz ambiental (Baer et al. 2016), o que por si só já pode resultar em variabilidade nas respostas das algas. Nossos resultados mostram claramente um efeito sinérgico na produção de biomoléculas, sejam elas, carotenóides, proteínas ou carboidratos quando se associa cobre com luz azul. Particularmente para K. contorta, a concentração do metal que resultou nos maiores valores de biomoléculas foi 3,8x10-9 mol L-1. 5. Conclusão O metabolismo de Kirchneriella contorta foi afetado pela combinação de estresse, expondo-a ao cobre e LED azul ou vermelho. Variação de cobre no cultivo não resultou em mudanças nos parâmetros de crescimento, mas este em combinação com luz azul promoveu maiores taxas de crescimento na microalga. O aparato fotossintético mostrou-se sensível às mudanças na qualidade da luz e à presença do cobre na amplitude de concentrações usada. A partir de 1,4x10-8 mol L-1 de Cu2+ houve um aumento da dissipação não fotoquímica NPQ, mas que conseguiu superar o estresse, mantendo os rendimentos fotossintéticos similar ao controle. O efeito sinérgico não ocorreu somente na produção de biomoléculas, mas também refletiu-se no aumento de NPQ, que ocorreu quando as células foram expostas aos LEDs azul e vermelho. Em relação à composição bioquímica, clorofilas a e b, carboidratos e proteínas apresentaram maiores produtividades em concentrações intermediárias de cobre nas primeiras 48 h de cultivo. Na concentração de 3,8x10-9 mol L-1 de Cu2+ livre e exposição à luz azul ou vermelha, aumento de mais de 50% na produtividade de carotenoides, carboidratos e 30% de proteínas foi obtido sem detrimento da taxa de crescimento e, portanto, mesmo produzindo mais biomoléculas, permaneceu a geração de biomassa algal. Mostramos que, se fornecidos em quantidade correta, o cobre pode estimular a produtividade de biomoléculas, e que essa produtividade pode ser magnificada por sinergismo mediante a combinação de estímulos/estresses, apresentado aqui como cobre e LED azul. Essa dupla mostrou-se ótima ferramenta para a manipulação bioquímica e crescimento de Kirchneriella contorta. 33 6. Referências Abiusi, F., Sampietro, G., Marturano, G., Biondi, N., Rodolfi, L., D'Ottavio, M., & Tredici, M. R. (2014). Growth, photosynthetic efficiency, and biochemical composition of Tetraselmis suecica F&M‐M33 grown with LEDs of different colors. Biotechnology and bioengineering, 111(5), 956-964. Afkar, E., Ababna, H., & Fathi, A. A. (2010). Toxicological response of the green alga Chlorella vulgaris, to some heavy metals. American Journal of Environmental Sciences, 6(3), 230. Aidar, E., Gianesella-Galvão, S. M. F., Sigaud, T. C. S., Asano, C. S., Liang, T. H., Rezende, K. R. V., ... & Sandes, M. A. L. (1994). 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