UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA DAVILENE GIGO BENATO ANÁLISE DA REGENERAÇÃO DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS EM LESÕES MODERADAS E GRAVES SOB AÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE. SÃO CARLOS - SP 2010 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA DAVILENE GIGO BENATO Orientador: Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto ANÁLISE DA REGENERAÇÃO DO NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS EM LESÕES MODERADAS E GRAVES SOB AÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE. Apoio Finaceiro: FAPESP-Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo. Proc. N° 06/52931-4 SÃO CARLOS – SP 2010 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Fisioterapia. Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária/UFSCar G461ar Gigo-Benato, Davilene. Análise da regeneração do nervo isquiático de ratos em lesões moderadas e graves sob ação do laser de baixa intensidade / Davilene Gigo Benato. -- São Carlos : UFSCar, 2010. 61 f. Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2010. 1. Fisioterapia. 2. Laserterapia. 3. Axôniotmese. 4. Neurotomia. 5. Função neuromuscular. 6. Metaloproteinase (MMP-2). I. Título. CDD: 615.82 (20a) MEMBROS DA BANCA -RA PARA DEFESA DE TESE DE DavaaC Gig0 Bemato, APRESENTADA A 0 PROGRAMA DE POS GRADUACAO EM KSIO-IA DA UNIWERSIBADE FEDERAL DE SAO CARLOS, EM 17 DE MAR@ DE 2010. BANCA EXAMINADORA: (UFSCar) A do.. ana Macher Teodori (UNIMEP) #(--. Stela r la M ttiello Gon~alves Rosa Dedicatória Á Deus por colocar tudo em minha vida no seu devido tempo e lugar. Aos meus familiares e amigos por toda sua colaboração e carinho AGRADECIMENTOS Agradeço a todos aqui citados pela ajuda na realização dessa dissertação (ordem alfabética): Ademar amigo marceneiro que construiu nosso “corredor” para a realização do teste funcional. Aluna: Érika Harumi Tanaka, pela dedicação, força de vontade, disciplina, por me ajudar sempre nos experimentos mesmo na hora do almoço, feriados e festas. Ressalto aqui minha grande gratidão pela super ajuda. Não foi uma simples ajudante, mas sim, uma colaboradora. Professoras Ana Beatriz de Oliveira e Anielle Cristhine de Medeiros Takahashi pela ajuda na utilização do software Matlab e por terem montado a rotina para nós, e lógico pelo grande companheirismo. Carla Tim, sem essa maravilhosa pessoa não sei o que seria da minha tese. Obrigada do fundo do coração por todos os esforços que fez. Feriados importantes foram perdidos para me ajudar. Obrigada parceira. Colegas de laboratório: Carla, Charles Taciro, Elaine, Jaqueline, Lívia, Poliani, Natália, Renan, Vivian Cury. Obrigada por sempre me darem uma forcinha nas horas de dificuldade. Colegas de laboratório Plasticidade Muscular (vizinhos): Carolina, Cristina, Christiani, Esperanza, Gabriel, João, Marcela, Sabrina , Paula, Teresa e Thiago. Obrigada por toda a ajuda e paciência que sempre tiveram comigo, vocês são realmente muito amigos. FAPESP por me subsidiar por esses anos e me apoiar na pesquisa com a reserva técnica. Profa. Heloísa Selistre, por me ceder seu laboratório de fisiologia (UFSCar) e sua estrutura para alguns procedimentos. Profa. Juanita Anders por me receber tão bem em seu laboratório no Department of Anatomy, Physiology and Genetics Uniformed Services University of the Health Sciences. Agradeço todas as discussões e ensinamentos que contribuíram muito para o enriquecimento desse trabalho. Secretárias da pós-graduação Kelly e Cris, por sempre me darem uma mãozinha nas questões burocráticas da Universidade. Ms. Lívia Ribeiro de Assis pelas análises da zimografia e ajuda no processo de coleta de material para análise dos grupos da axoniotmese. Fisiot. Marcela, obrigada pela sua disponibilidade para sempre me ajudar, pelo processamento e análises dos músculos e ajuda em geral dentro do laboratório. Profa. Marisa, por ceder seu laboratório de Fisiologia-UFSCar e seus equipamentos, assim como seu pessoal para me auxiliar. Profa. Marise do laboratório de Fisiologia-UFSCar, por ter cortado e corado todos os nervos em historesina. Prof. Milton Benato (Mirtão), pelas ajudas das traduções e versões de inglês. Prof. Doutor Nivaldo Antonio Parizotto por me acolher em seu laboratório com tanta alegria e me acompanhar nessa tragetória . Profa Tania de Fátima Salvini por me ceder o espaço do seu laboratório, pelas orientações e análises dos músculos. Principalmente pelo apoio de “mãe”. A técnica de laboratório Teresa que sempre me ajudou a preparar soluções e dava dicas interessantes. Doutor Thiago Luiz de Russo por ter me ajudado em todas as etapas de todo esse trabalho. A palavra “obrigada” é pouco por tudo que ele fez nessa tese. Sem ele, com certeza essa tese não teria sido finalizada. Obrigada também por ter sido tão companheiro e dedicado. Xingia técnica da Profa. Juanita Anders no Department of Anatomy, Physiology and Genetics Uniformed Services University of the Health Sciences. Agradeço todos os ensinamentos, e discussões. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIAÇÕES RESUMO ix ABSTRACT x 1. INTRODUÇÃO 01 1.1. Ação da Leserterapia no tecido nervoso 03 1.2. Ação do laser na regeneração do nervo 05 2. OBJETIVO 11 3. MATERIAIS E MÉTODOS 12 3.1. Animais 12 3.2. Procedimentos Cirúrgicos 12 3.2.1. Protocolo de lesão por esmagamento 12 3.2.2. Protocolo de lesão término-terminal 13 3.3. A Laserterapia (Aplicação do Laser) 14 3.3.1. Protocolo de Aplicação do Laser Pós- Axoniotmese 14 3.3.2. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Neurorrafia Termino-terminal 15 3.4. Grupos Experimentais 15 3.5. Avaliação Funcional 16 3.6. Avaliação Morfológica e Imunofluorescência 17 3.7. Avaliação Morfométrica das Fibras Nervosas Regeneradas 18 3.8. Avaliação do Músculo 18 3.9. Análise zimográfica 19 3.9.1. Dosagem de proteínas 19 3.9.2. Zimografia 19 3.10. Avaliação Estatística dos Dados 20 4. RESULTADOS 21 4.1 Grupos com esmagamento do nervo 21 4.1.1. Teste Funcional 21 4.1.2. Histologia dos músculos Tibiais Anteriores (TA) 24 4.1.3. Área de Secessão transversa (AST) das fibras musculares 25 4.1.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA 25 4.1.5. Análise histológica do Nervo Ciático 26 4.1.6. Análise Morfométrica do Nervo Ciático 30 4.1.6.1. Número de Fibras por campo 30 4.1.6.2. Área de secção transversa (AST) da mielina, axônio e fibras nervosas. 30 4.1.7. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no nervo ciático 31 4.2. Grupos neurorrafia Termino-Terminal 33 4.2.1. Teste Funcional 33 4.2.2. Histologia dos músculos TA (Tibial Anterior) 34 4.2.3. Área de secção transversa (AST) das fibras musculares 36 4.2.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA 36 4.2.5 Histologia do nervo ciático 37 4.2.5.1. Análise histológica do Nervo Ciático 37 4.2.6. Área de secção transversa do nervo ciático 41 4.2.6.1. Número de fibras nervosas 41 4.2.6.2. Área de secção transversa (AST) de mielina, axônio e fibra nervosa. 41 5. DISCUSSÃO 43 6. CONCLUSÃO 50 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51 ANEXO 1. Atividades Realizadas No Período 58 ANEXO 2. Artigo Submetido À Publicação-2010 61 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Procedimento de lesão de esmagamento. 12 Figura 2. Cirurgia Neurorrafia termino-terminal. 13 Figura 3. Parâmetros de aplicação do laser. 14 Figura 4. Análise funcional da marcha do rato. 16 Figura 5. Resultado do teste funcional CR660nm. 22 Figura 6. Resultado do teste funcional CR780nm. 22 Figura 7. Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA. 24 Figura 8. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA. 25 Figura 9. Atividade total da MMP2 nos grupos CR. 26 Figura 10. Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados. 28 Figura 11. Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados com anti-S100. 29 Figura 12. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. 30 Figura 13. Área de secção transversa de mielina, axônio e fibra nervosa em nervo ciático dos diferentes grupos experimentais. 31 Figura 14. Atividade total da MMP-9 observada nos diferentes grupos experimentais. 32 Figura 15. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. 33 Figura 16. Índice funcional do nervo ciático nos diferentes grupos experimentais. 34 Figura 17. Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA. 35 Figura 18. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais. 36 Figura 19. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. 37 Figura 20. Cortes histológicos dos nervos ciáticos, impregnados com tetróxido de ósmio. 39 Figura 21. Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com anti-S100 40 Figura 22. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. 41 Figura 23. Área de secção transversa da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa em nervo ciático dos diferentes grupos experimentais. 42 LISTA DE TABELAS Tabela 1 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AChRs Receptores de acetilcolina . AST: Área de Secção Transversa. BCA: Ácido bicinconínico. CR: Crush = esmagamento. GaAlAs: Arseneto de Gálio e Alumínio. IFC: Índice Funcional do Ciático. J: Joule. J/cm2: Joule Por Centímetro Quadrado. JNM: Junção Neuro Muscular. MEC: Matriz Extracelular. M.: Músculo. MMPs: Metaloproteinases de Matriz. mW: Mili Watts. Nm: Nanômetros. N: Normal. PO: pós-operatório. TA: Tibial Anterior. TGF- β1: Fator de Crescimento Transformador Beta 1. TIMP: Inibidores Teciduais das Metaloproteinases. TNF α: Fator de Necrose Tumoral Alfa.. TT: Neurorrafia Termino-Terminal. vi RESUMO O objetivo do estudo foi analisar a ação dos lasers de baixa intensidade (GaAlAs) com diferentes comprimentos de ondas (660 e 780 nm), em diferentes densidades de energia (10 J/cm², 60 J/cm² e 120 J/cm2) na regeneração do nervo ciático do rato após lesões moderadas (axoniotmese) e graves (neurotmese). Para tal, 128 ratos Wistar (275 g) foram divididos em 16 grupos: Para axoniotmese: Normal (N); axoniotmese (CR); axoniotmese irradiado com laser 660 nm com 10 J/cm2 (CR660 10J); CR660 60J; CR660 120J; CR780 10J; CR780 60J; CR780 120J. Para neurotmese: N; neurotmese (TT); TT660 10J; TT660 60J; TT660 120J; TT780 10J; TT780 60J; TT780 120J. A estimulação a laser foi realizada com potência fixa de 40 mW e área do feixe de 4,0 mm2. O laser foi aplicado durante 10 dias consecutivos, a partir do primeiro dia do pós-operatório nos nervos com axoniotmese e neurotmese. Entretanto, para os grupos neurotmese foi acrescido de mais um mês de aplicação em dias alternados. Os músculos tibiais anteriores (TA) e os nervos ciáticos foram avaliados após 28 (axoniotmese) e 84 dias (neurotmese) após a cirurgia. Para investigar a área de secção transversa (AST) das fibras musculares, axônios, mielina e fibra nervosa; número de fibras nervosas foi feita morfometria. A atividade das metaloproteinases de matriz (MMPs) 2 e 9 foi realizada para observar o remodelamento da matriz. O índice funcional do nervo ciático foi para avaliar a função. A imunoflorescência com anticorpo S-100 foi utilizada para a observar a bainha de mielina e células de Schwann. Os dados foram submetidos a testes de homogeneidade e normalidade. Os testes Anova one-way seguido por Tukey e Kruskal-Wallis seguido por Newman-Keuls foram usados em amostras paramétricas e não paramétricas, respectivamente. Um nível de significância de 5% foi adotado. Os resultados deste estudo mostram que os grupos axoniotmese irradiados com lasers 660 nm 10 e 60 J/cm2, 780 nm 10 e 120 J/cm2 apresentaram AST da fibra nervosa e da mielina semelhante aos valores normais. O laser 660 nm, independente da densidade de energia utilizada, acelerou a recuperação da atrofia muscular e aumentou a atividade da MMP-2 nos nervos ciáticos dos grupos axoniotmese. Ele também reduziu a atividade da MMP-9 nos nervos e da MMP-2 nos músculos. Todos os animais submetidos à axoniotmese recuperaram a função normal após 28 dias de lesão. Em relação aos grupos neurotmese, foram observados valores superiores de AST da bainha de mielina e de fibra nervosa no grupo TT660 120J comparado ao TT. Valores de AST das fibras musculares foram superiores ao TT nos grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J. Estes parâmetros de laser também foram eficientes em promover a diminuição da atividade de MMP-2 nos músculos TA. Todos os grupos submetidos à neurotmese não recuperaram totalmente a função após 84 dias de lesão. Com base no objetivo proposto podemos concluir vi que a laserterapia, em determinados protocolos de aplicação, mostrou-se efetiva na recuperação do nervo, evitou a atrofia do muscular e atuou no remodelamento da matriz extracelular do músculo e do nervo periférico via regulação das MMPs. Palavras Chave: Axoniotmese, Neurotmese, regeneração do nervo ciático, Laser terapia de baixa intensidade. vi ABSTRACT Peripheral nerves are frequently target of traumatic injuries and their functional recovery is generally incomplete. The aim of the present study was to evaluate the effects of 660 or 780 nm low-level laser therapy (LLLT) GaAlAs using different energy densities (10, 60 and 120 J/cm2) on nerve sciatic recovery after severe (neurotmesis) or moderate (axonotmesis) injuries in rat. One hundred and twenty eight Wistar male rats (275g) were divided into 16 groups, and they were performed as follow: For axonotmesis: Normal (N); axonotmesis (CR); axonotmesis and 660 nm LLLT with 10 J/cm2 irradiation (CR660 10J); CR660 60J; CR660 120J; CR780 10J; CR780 60J; CR780 120J. For neurotmesis: N; neurotmesis (TT); TT660 10J; TT660 60J; TT660 120J; TT780 10J; TT780 60J; TT780 120J. The LLLT irradiation was performed using a fix potence of 40 mW and a spot area of 4 mm2. Nerves submitted to axonotmesis or neurotmesis were irradiated with LLLT daily during 10 consecutive days starting on the first post-operatory. However, neurotmesis groups received additionally one month of LLLT applied every other day. Tibialis anterior (TA) muscles and sciatic nerve were evaluated 28 (axonotmesis) and 84 (neurotmesis) after surgery. The follow analyses were performed: muscle fiber, axon, myelin and nerve fiber cross-sectional area (CSA); matrix metalloproteinases (MMP) 2 and 9 activities; sciatic functional index; S-100 immunofluorescence. Data were submitted to homogeneity and normality tests. Anova one-way followed by Tukey tests and Kruskal-Wallis followed by Newman-Keuls tests were performed when data was parametric or non-parametric, respectively. Significance level was set at 5%. The results of the present study showed that groups irradiated with 660 nm LLLT with 10 or 60 J/cm2, and 780 nm 10 or 120 J/cm2 showed normal values of nerve fiber and myelin CSA. The 660 nm LLLT, regardless the energy density used, accelerated muscle fiber recovery and increased the MMP-2 activity in nerve. Furthermore, it also decreased the MMP-9 and MMP-2 activities in nerves and muscles respectively. All axotomized animals recovery normal levels of function on the 28 day after surgery. Regarding neurotmesis groups, TT660 120J presented higher values of myelin and nerve fiber CSA compared to TT. Superior values of muscle fiber CSA were observed in TT660 60 e 120J e TT780 10J compared to TT. These LLLT parameters were also efficient to decrease MMP-2 activity in TA muscles. All groups submitted to neurotmesis did not recover normal function after 84 days of injury. Based on the proposed objective, it is possible to conclude that LLLT, considering specific protocols vi of application, recovered nerves effectively, avoided muscle fiber atrophy and acted on the muscle and nerve extracellular matrix remodeling via MMPs regulation. 1 1. INTRODUÇÃO As lesões nervosas periféricas são ocorrências clínicas comuns que afetam principalmente os nervos que percorrem os membros periféricos (EVANS et al., 2005) causando muita incapacidade (GIGO BENATO et al., 2005). Segundo um estudo realizado nos EUA, 50 mil sujeitos sofrem lesões traumáticas nos nervos a cada ano (MILESI et al.,2000 ; EVANS et al.,2001). Num estudo brasileiro, de 456 casos analisados, 45% das lesões nervosas periféricas eram do tipo axoniotmese, 41% neurotmese e 14 % neuropraxia. (KOUYOUMDJIAN et al., 2006). A gravidade do dano nervoso pode variar muito em relação às dimensões do evento traumático (LUNDBORG, 2000). O tempo de recuperação varia de acordo com a extensão da lesão, tanto na axoniotmese quanto na neurotmese (LUNDBORG, 2000). Em lesões graves em que há a ruptura total no nervo, como na neurotmese, é necessária a intervenção cirúrgica (SEDDON et al., 1943 ; SUNDERLAND 1978; LUNDBORG, 2000). Na lesão do tipo axoniotmese, mesmo com a preservação dos tubos endoneurais, se a compressão for muito extensa, as fibras axonais demoram um tempo considerável para crescer (SEDDON et al., 1943 ; SUNDERLAND 1978), e quanto mais tardio o restabelecimento das conexões neuromusculares, mais atrofia muscular se desenvolve. Com isso, prolonga-se o tempo para restabelecer a função neuromuscular (RCHKIND, GEUNA & SAINBERG, 2009,b). Contudo, além do tipo da lesão (axoniotmese ou neurotmese), é importante considerar também sua extensão e o tipo de intervenção cirúrgica. Essas três características interferem no prognóstico de recuperação pós- lesão nervosa periférica (GIGO-BENATO et al., 2005). Além das alterações ocorridas no nervo, outro tecido que é bastante afetado após uma lesão nervosa periférica é o músculo esquelético. A inervação é um fator crítico para a integridade funcional e estrutural do músculo (ISHIDO, KAMI & MITSUHIKO, 2004; KOSTROMINOVA, 2005). A lesão do nervo causa uma profunda perda de massa e capacidade de geração de força do músculo (BILLINGTON & CARLSON, 1996; DOW, 2004). As lesões nervosas periféricas podem causar muitas modificações na estrutura, metabolismo e expressão gênica do músculo esquelético. Uma mudança importante que ocorre quando músculos tornam-se desnervados é o aumento de receptores de acetilcolina (AChR) no sarcolema. Os receptores de acetilcolina são normalmente expressos na junção neuromuscular em músculos inervados. Entretanto, a 2 desnervação causa aumento e proliferação de AChRs extrajuncionais. Alguns autores vêem isso como um tipo de “sinal” que causa brotamentos de novos axônios dos nervos e também como uma forma de preparação para a formação de uma nova junção neuromuscular (LIEBER, 2002). O músculo quando é desnervado, ocorre um remodelamento da matriz extracelular (Demestre et al, 2005) e as metaloproteinases de matriz (MMPs) tem um papel importante nas modificações dessa matriz extracelular (SCHOSER & BLOTTNER, 1999; AHTIKOSKI et al., 2004; DEMESTRE et al., 2005). As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas zinco-dependentes que podem ser sintetizadas e secretadas por células presentes no músculo esquelético, como as células de Schwann, axônios, células satélites e fibroblastos (CARMELI 2004). As funções das MMPs no músculo desnervado ainda não são bem esclarecidas e apenas alguns estudos investigaram seu papel nas doenças neuromusculares (KHERIF et al., 1998; SCHOSER & BLOTTNER, 1999; KOSKINEN et al., 2000; SCHOSER, BLOTTNER & STUERENBURG, 2002; AHTIKOSKI et al, 2004; DEMESTRE et al., 2005). Em músculos normais de camundongo, a MMP-2 e a 9 foram localizadas na junção neuromuscular (JNM), em células de Schwann e no perineuro de nervos intramusculares (KHERIF et al., 1998). Entretanto, depois da lesão por esmagamento, as MMPs permanecem presentes na JNM (KHERIF et al., 19988, DEMESTRE et al., 2005) mas também podem ser encontradas ao redor de fibras musculares, capilares, na matriz extracelular ou em células mononucleadas (DEMESTRE et al., 2005). Dentre as metaloproteinases de matriz a MMP-2 (gelatinase A) e a MMP-9 (gelatinase B) são enzimas chaves no processo de remodelamento da matriz extracelular no músculo esquelético durante mudanças de demanda de atividade e respostas frente a lesões (CARMELI et al., 2004). Ambas são conhecidas por degradar a forma não fibrilar de colágeno tipo IV, desnaturar colágenos intersticiais, assim como a matriz extracelular (AHTIKOSKI et al., 2004). O remodelamento da matriz extracelular no nervo também é importante para compreender o processo de reestruturação do nervo pós-lesão. Apesar das MMPs serem muito estudadas, ainda não está claro e definido quais são os papéis que cada uma desempenha no sistema nervoso (C.I. PLATT et al., 2003). Estudos sugerem que a MMP-2 e MMP-9 estão envolvidas na facilitação do crescimento axonal ao longo da matriz do nervo após axoniotmese ( C.I. PLATT et al., 2003; HEINE et al. ,2004,). Autores questionam que a MMP-2 possa degradar colágeno, principalmente o tipo IV, que é rico no segmento distal do nervo pós-esmagamento. Eles acreditam que essa degradação do 3 colágeno possa criar canais pelos quais os brotos axonais possam crescer. O aumento da atividade da MMP2 está intimamente relacionado ao aumento do fator de necrose tumoral (TNF α) que é secretado pela célula de Schwann, após uma lesão do nervo (SHUBAYEV & MYERS, 2000; SIEBERT et al.,2001). Já a alta atividade da MMP-9 é mais encontrada no segundo e terceiro dia pós-lesão, quando ocorre infiltração de macrófagos no nervo lesado. Estes macrófagos (juntamente com as células de Schwann) são responsáveis pela eliminação de mielina e outros detritos na região nervosa distal à lesão. O aumento no início da MMP-9 pode ajudar a quebrar a barreira sangue- nervo e, assim, facilitar a infiltração de macrófagos do sangue para o tecido nervoso. (LA FLEUR ET AL., 1996, C.I. PLATT ET AL., 2003). A barreira sangue nervo impede seletivamente a passagem de substâncias para o espaço extracelular que envolve as fibras nervosas no endoneuro, limitando a penetração de macromoléculas e controlando a passagem de íons para o espaço endoneural, protegendo as fibras nervosas de vários agentes nocivos (CAVANAGH, 1990). Outra possível hipótese é que os macrófagos residentes possam ser ativados após esmagamento do nervo, contribuindo para estimular a atividade MMP-9 (C.I. Platt et al., 2003). A regeneração nervosa periférica já é um fato fundamentado e, por esta razão, pesquisas são realizadas no intuito de detalhar os fatores, mecanismos, terapêuticos e técnicas designadas à restauração nervosa (CRISCI & FERREIRA, 2002). Todavia, a recuperação funcional é muito relativa entre um paciente e outro sendo raramente completa (AZZE & MATTAR, 2000) e nem sempre satisfatória (SUNDERLAND, 1978; LUNDBORG, 2000). Portanto, se dá muita importância ao tratamento de recuperação no pós-operatório, com a finalidade de garantir a todos os pacientes a suficiente restauração da função neuromuscular. Partindo dessa necessidade de restabelecer a função neuromuscular, o processo de reabilitação conta com várias terapias físicas, tais como, laser de baixa intensidade, ultrassom, estimulação elétrica, entre outros, na tentativa de influenciar positivamente a melhora da função (GIGO-BENATO et al., 2005). 1.1. Ação da Laserterapia no tecido nervoso A laserterapia na regeneração do nervo recebeu uma crescente atenção por volta de 20 anos atrás (ROCHKIND & OUAKNINE,1992; ANDERS et al., 2004). Porém, a ação do laser no 4 sistema nervoso ainda não está bem definida, mas durante a última década grandes avanços ocorreram para a compreensão dos efeitos celulares e moleculares da aplicação do laser nos tecidos biológicos (TURNER & HODE, 2003). Com base nos resultados obtidos até hoje, principalmente estudos in vitro, várias teorias foram desenvolvidas para explicar as alterações que a laserterapia exerce, como por exemplo, mudanças nas estruturas biológicas, tais como o aumento de síntese de ATP ou (GAGLIARDI, ATLANTE & PASSARELLA, 1997; AMAT et al., 2005) a proliferação celular (KREISLER et al., 2003) Estudos in vitro mostraram que a laserterapia induz o crescimento massivo de neuritos em neurônios em cultura. (WU et al., 19870; 2009 ;WOLLMAN, ROCHKIND & SIMANTOV, 1996). A laserterapia parece acelerar o crescimento precoce das células nervosas. As células irradiadas com o laser já crescem 24 horas após seu cultivo. Na primeira semana essas células irradiadas podem conter alto número de neurônios, com um citoplasma grande, fibras neuronais ramificadas, interligadas e formando redes. Esse padrão de crescimento das células cultivadas e irradiadas mostra-se acelerado ao se comparar com o normal. O desenvolvimento padrão é que esses neurônios crescem e se tornam grandes somente após várias semanas em cultura. (ROCHKIND et al., 2009 a). Outro possível mecanismo de ação do laser no tecido nervoso é a ação neuroprotetora, que facilita o processo de regeneração das fibras nervosas. A aplicação da laserterapia após lesão do nervo inibe a atividade do óxido nítrico (um agente neurotóxico) e aumenta a expressão do fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) (LEUNG et al., 2003). Uma fascinante hipótese é que a laserterapia possa guiar os cones de crescimento neuronal in vitro, talvez devido à sua interação com a proteína citoplasmática, e particularmente, a um aumento da proliferação em direção a margem do axônio (EHRLICHER et al., 2002). Além disso, há demonstração experimental que a irradiação a laser seja capaz de estimular a proliferação das células de Schwann de ratas in vivo apontando para outro mecanismo de efeito direto no crescimento do axônio. Essa evidência comprova que a laserterapia exerce um efeito de regeneração nervosa periférica (VAN BREUGEL & BAR, 1993). Considerando a presença de um número adequado de células de Schwann como sendo um fator importante no sucesso da regeneração nervosa, a laserterapia desempenha uma ação gliotrófica que representa uma forte indicação a favor de seu uso no pós- traumático ou pós-cirúrgico na reparação nervosa periférica (GEUNA et al., 2003). 5 Além do laser terapêutico exercer ação direta nos componentes neurais, ele auxilia na função dos músculos desnervados que podem ser restaurados parcialmente num grau muito considerável, se o tratamento for iniciado logo após a lesão do nervo (ROCHKIND et al., 2009 a, b,c,d). 1.2. Ação do laser na regeneração do nervo Por mais que existam vários estudos in vitro que investiguem a real efetividade da laserterapia na regeneração do nervo ainda existem muitas controvérsias (GIGO-BENATO, GEUNA &. ROCHKIND, 2005; ANDERS, GEUNA & ROCHKIND, 2004) sobre a escolha do melhor protocolo de tratamento (tipo de comprimento de onda e densidade de energia) para cada tipo de lesão nervosa periférica. A laserterapia tem demonstrado ser efetiva na aceleração da recuperação da função neuromuscular. Numa recente revisão crítica da literatura (GIGO- BENATO, GEUNA &. ROCHKIND, 2005; ANDERS, GEUNA & ROCHKIND,2004), mostrou- se que mais de 80 % dos estudos experimentais, conduzidos até hoje sobre o uso da laserterapia na promoção da regeneração nervosa periférica, levam a uma positiva recuperação nervosa após axoniotmese e após cirurgia reparadora. As características de cada artigo estão apresentadas em uma tabela atualizada com os estudos relacionados ao tema (Tabela 1). Os estudos publicados na década de 80 se basearam no uso do modelo de axoniotmese (ROCHKIND et al., 1988; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). Esses estudos concluíram que a laserterapia foi efetiva na recuperação nervosa. Os efeitos desta laserterapia foram medidos em um curto espaço de tempo, ou seja, dentro de dias e minutos assim como em longo prazo por vários dias e meses (ROCHKIND et al., 1986; ROCHKIND et al., 1987 a,b; ROCHKIND & OUAKNINE, 19920). No modelo experimental em curto prazo, foi aplicado o laser diretamente no nervo ainda exposto (ROCHKIND, BARR-NEA & VOLGER, 1990; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). Os comprimentos de onda 540 nm, 632 nm e 780 nm foram os que produziram os melhores efeitos. Já no modelo a longo prazo, o nervo ciático foi estimulado diretamente. Os autores encontraram, segundo a atividade eletrofisiológica, uma redução da atividade após a lesão de esmagamento nos nervos não irradiados, mas o uso da laserterapia (comprimento de onda de 632.8 nm, densidade de energia de 10 J/cm²) melhorou o potencial de ação após a lesão por esmagamento no período a longo prazo (ROCHKIND et al., 1987a;b; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). A aplicação da laserterapia após lesão por esmagamento aumentou o crescimento axonal, acelerando a recuperação do nervo ciático (ROCHKIND et al., 1987a ; ROCHKIND et al., 1987b; ROCHKIND & OUAKNINE, 1992). 6 Existem trabalhos que mostram que se o laser for aplicado tanto no segmento da medula espinhal correspondente ao nervo, quando no nervo lesado, o tempo e a qualidade da recuperação nervosa são melhores do que aqueles grupos que só receberam irradiação no nervo (ROCHKIND et al., 2001; SHAMIR et al., 2001; LEUNG et al., 2002; LUCAS et al., 2002, WU et al., 2009). Estudos demonstram a aplicação de laser na medula e no nervo é eficiente para a indução de proliferação de astrócitos e oligodendrócitos, com isso, levando a uma diminuição das mudanças degenerativas no nervo. Isto sugere um aumento do metabolismo nos neurônios, quando submetidos à influência do tratamento a laser e melhora a habilidade de produção de mielina (ROCHKIND, BARR-NEA & VOLGER, 1990). A laserterapia aplicada na medula também tem sido estudada e mostrou uma grande perspectiva nas lesões medulares. Um estudo verificou que a aplicação transcutânea de laser 810 nm durante 14 dias consecutivos (1,589 J/cm2 ao dia) sobre a medula espinhal levou a um maior número de axônios e melhora da função neuromuscular em animais com lesão medular, em comparação ao grupo que não recebeu o tratamento (WU et al., 2009). Estudos experimentais usaram a laserterapia após lesão de esmagamento, demonstraram que a laserterapia promove a regeneração nervosa (KHULLAR et al., 1995; SHIN et al., 2003), nervo fibular (HAMILTON, KEVEN & RAY, 1992), e facial (ANDERS et al., 1993). Khullar (1995) e seus autores, aplicaram transcutaneamente o laser 820nm (48 J/cm²), por 28 dias, iniciado a partir do primeiro dia do pós-operatório, mostraram que, ocorreu uma aceleração na recuperação ,nos animais tratados em comparação aos não tratados. Um resultado similar foi obtido num estudo o qual utilizou o laser de comprimento de onda de 630 nm (emissão de irradiação contínua) com aplicação transcutânea a partir do primeiro dia do pós-operatório, num período de somente cinco dias, em lesão por axoniotmese no nervo ciático (SHIN et al., 2003). Esses resultados sugerem que a laserterapia é mais efetiva quando aplicada logo após o período pós-traumático. Um estudo conduzido por Hamilton, Keven e Ray (1992) os quais irradiaram (laser 632.8 nm, 3,52 J/cm², aplicação transcutânea) o nervo fibular esmagado de coelho já a partir do primeiro dia pós-lesão, durante 15 dias, demonstrou uma melhora significativa na recuperação do potencial de ação em comparação com o grupo não tratado. Anders e colaboradores (1993) realizaram um o estudo mais completo comparando diferentes comprimentos de onda de laser (361 nm, 470 nm, 514 nm, 632.8 nm, 1061 nm) sobre a regeneração do nervo facial. Os resultados desse estudo confirmaram todos os estudos anteriores 7 que demonstraram que a fototerapia aplicada transcutaneamente, diariamente, a partir do primeiro dia do pós-operatório, leva a um significante aumento da velocidade de regeneração dos axônios nos nervos faciais em comparação aos animais não tratados. (ANDERS et al., 1993; ANDERS, GEUNA & ROCHKIND, 2004). Neste estudo, todos os comprimentos de onda foram efetivos na estimulação da regeneração após lesão nervosa, mas o melhor resultado foi obtido pelo laser de comprimento de onda de 632,8 nm. Um estudo (BAGIS et al., 2003) não encontrou nenhum efeito da laserterapia na recuperação nervosa periférica. Os nervos ciáticos dos ratos receberam esmagamento bilateral, um dos lados foi estimulado com laser de comprimento de onda de 904 nm, com diferentes densidades de energia (0,31 J/cm² e 19 J/cm²), e o outro nervo serviu como controle da lesão. A eletrofisiologia e a morfologia destes nervos não mostraram diferenças significantes entre lesão e lesão mais irradiação. Entretanto, é difícil dizer que o resultado desse estudo seja fortemente confiável, pois é difícil considerar resultados negativos usando o lado contra lateral “não tratado” como controle. Principalmente se considerarmos que a laserterapia pode exercer efeitos sistêmicos, além da ação da regeneração nervosa, (ROCHKIND et al., 1989), contudo o uso do lado contralateral é inapropriado nesse contexto. Seis estudos experimentais contribuíram com novas e importantes informações no que diz respeito aos resultados obtidos sobre modelo de lesão de neurotmese e tratamento com o laser. No primeiro estudo a laserterapia no pós-operatório demonstrou ser efetiva na promoção da regeneração nervosa periférica, no caso de transecção completa e reparação término-terminal (SHAMIR et al., 2001). Esse estudo aplicou transcutaneamente o laser, com comprimento de onda de 780 nm, por 30 minutos, durante 21 dias consecutivos na região da cirurgia do nervo ciático, assim como na medula espinhal. A resposta somatossensorial positiva foi encontrada em 69% dos ratos irradiados em comparação com os 18 % dos ratos não irradiados. A avaliação com imunoistoquímica do grupo tratado com laser mostrou maior intensidade de crescimento axonal e melhor qualidade de regeneração, com um aumento do número de fibras nervosas de médio e grande diâmetro. Esta descoberta sugere que a laserterapia aumenta o processo regenerativo após a lesão completa e sutura término-lateral no nervo. O segundo estudo utilizou a técnica término-terminal em coelhos da Nova Zelândia. Uma boa regeneração foi observada nos grupos tratados com laser, representada pelo maior calibre dos axônios dos nervos e uma espessa camada de bainha de mielina em comparação ao grupo não 8 tratado. Esse estudo utilizou comprimento de onda 901 nm com laser diodo (10 diodos, potência média de 2 mW de repetição de pulso) GaAlAs, irradiação foi feita a partir do primeiro dia do pós-operatório, por dez dias consecutivos (MOHAMMED, AL-MUSTAWFI & KAKA, 2007). Alguns pesquisadores acreditam que o laser possa auxiliar no processo cicatricial já no momento da cirurgia, ajudando unir os dois cotos e melhorando o prognóstico da função (MOHAMMED, AL-MUSTAWFI & KAKA, 2007; JOHNSON et al., 2007; O'NEILL et al., 2009 ). O terceiro investigou os efeitos da laserterapia no pós-operatório do nervo alveolar inferior reparados com tubulização (tubo Gore-tex) em coelhos. O resultado demonstrou que a laserterapia promoveu a regeneração nervosa, ao longo do enxerto sintético, o qual serviu como uma ponte para a junção dos dois cotos. No local onde o nervo alveolar inferior foi reparado, foi aplicado o laser de 820-830 nm transcutaneamente com 29 J/cm², em um ponto, por quatro dias consecutivos, iniciado a partir do primeiro dia do pós-operatório, seguido de seis sessões adicionais, uma vez por semana por seis semanas. A investigação morfológica sobre a regeneração nervosa demonstrou que ocorreu uma melhora no diâmetro das fibras nervosas em comparação com o não tratado (MILORO et al., 2002). No quarto estudo, ainda relacionado com tubulização [(tubo=ácido poliglicólico), (PGA Neurotube)], foi retirado um segmento do nervo ciático do rato (0,5 cm) e foi colocado o enxerto. O laser 780 nm (200 mW) foi aplicado 14 dias consecutivo, tanto na lesão distal, no tubo e proximal do nervo ciático, quanto na região correspondente ao nervo na medula espinhal (L3- L6). A eletrofisiologia após três meses de lesão mostrou que 70% dos animais irradiados tiveram resposta positiva. O teste funcional confirmou os resultados dos grupos irradiados com o laser que melhoraram sua função comparada com os não irradiados. Os animais tratados com laser mostram maior crescimento axonal em comparação com os não irradiados (ROCHKIND et al, 2009a;b;c;d). O quinto estudo (GEUNA et al., 2003; GIGO-BENATO et al., 2004) foi sobre o efeito positivo da laserterapia na regeneração do nervo mediano de rato reparado com a neurorrafia término-lateral no nervo ulnar intacto como doador. Após os ratos serem operados eles receberam a laserterapia por três semanas, três dias alternados, iniciadas a partir do primeiro dia do pós- operatório e foram comparados com o grupo operado com aplicação simulada (sham). Os lasers (808 nm e 905 nm) foram utilizados transcutaneamente, pontual no local da cirurgia, com densidade de energia 29 J/cm² e 40 J/cm² respectivamente. O resultado do estudo duplo cego 9 randomizado mostrou que a laserterapia induziu a uma significante e rápida mielinização, regeneração das fibras nervosas e recuperação da massa muscular, resultando num significativo rápido aumento da função em comparação com o grupo controle. No sexto estudo, Chen (2005) relatou a ocorrência de um efeito inibidor sobe a emissão do laser pulsado no comprimento de onda de 904 nm (densidade de energia aplicada: 2,33 a 15,5 J/cm²) no nervo ciático do rato. Esse efeito inibidor pode ser devido à utilização de um tubo de silicone de 10 milímetro de comprimento entre os cotos distais e proximais para a união dos cotos. O resultado negativo é de difícil interpretação, visto que foi obtido de um modelo experimental diferente dos outros em vários aspectos como o: 1) Uso de um tubo guia de silicone (o qual poderia interferir com a luz nesse comprimento de onda); 2) Uso de irradiação pulsada em alta freqüência (5-20 KHz); 3) Iniciaram a laserterapia após a primeira semana da cirurgia; 4) Estimulação prolongada (por 2 meses); 5) e tamanho de enxerto muito grande. Portanto, neste resultado o protocolo de estimulação a laser não só foi ineficaz quanto impediu a recuperação nervosa, com isso, revelou impróprio o seu uso. Como foi possível notar pela revisão da literatura, existem resultados conflitantes sobre o uso da laserterapia. Tais resultados podem ser resultantes de inúmeras variáveis técnicas (em particular o comprimento de onda, doses e tipos de irradiação) os quais se não forem adequadamente ajustados poderão reduzir o eventual sucesso do procedimento terapêutico (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005). Seguindo essa necessidade de estabelecer protocolos clínicos de aplicação da laserterapia ainda não testados. Este estudo teve a intenção continuar aprofundar a análise dessa irradiação sobre o nervo, focalizando especial atenção na escolha do tipo de comprimento de onda do laser, nos parâmetros de irradiação e também dois tipos de modelos experimentais de lesões nervosas (neurotmese e axoniotmese), os quais são aspectos relevantes nas perspectivas de aplicação em pacientes. Podendo assim, acelerar o prognóstico de recuperação desse indivíduo. 10 Autor (País) Ano Tipo de nervo lesão/reparação Modelo Experimental Tipo de laser Comprimento de Onda Tempo de Emissão Protocolo de tratamento Formas de mensuração Resultados Efeitos Rochkind et al. (Israel) 1987b esmagamento n. ciático do rato HeNe(contínuo) 632.8 nm 14 min 1° dia pós-op.,por 20 dias consec.(tot. = 20) Eletrofisiológica morfológica positivo Rochkind et al. Israel 1987b esmagamento n. ciático do rato HeNe(contínuo) 632.8 nm 7 min 1° dia pós-op.,por 20 dias consec.(tot. = 20) Eletrofisiológica morfológica positivo Hamilton et al. (USA) 1992 esmagamento n. fibularl do coelho HeNe 632.8 nm 9 min 1° dia pós-op.,por 15 dias consec.(tot. = 15) eletrofisiológica positivo Anders et al. (USA) 1993 esmagamento n. facial do rato HeNe (contínuo) 632.8 90 min 1° dia pós-op.,por 7-9 dias consec.(tot.= 7-9) morfológica positivo Khullar et al. (Noruega) 1995 esmagamento n. ciático do rato GaAlAs 820 nm 85 S 1° dia pós-op.,por 28 dias consec.(tot. = 28) funcional eletrofisiológica morfológica positivo Shin et al. (Coréia) 2003 esmagamento n. ciático do rato Semicondutor (contínuo) 650 nm 5min 1° dia pós-op.,por 5 dias consec.(tot. = 5) Funcional morfológica positivo Bagis et al. (Turquia) 2003 esmagamento n. ciático do rato GaAs (pulsado) 904 nm 15 min 1° dia pós-op.,por 7 dias consec.(tot. = 7) Eletrofisiológica morfológica nenhum Shamir et al. (Israel) 2001 Neurorafia termino- terminal n. ciático do rato AsGaAl(contínuo) 780 nm 30 min 1° dia pós-op.,por 20 dias consec.(tot. = 21) Eletrofisiológica morfológica positivo Miloro et al. (USA) 2002 Tubulização com Gore-Tex (8mm)(bilateral) n. alveolar inferior do coelho GaAlAs (contínuo) 820-830 nm 90 s 1° dia pós-op., por 4 dias consec, mais 1 dia por semana por 6 semanas (tot. = 10) morfológica positivo Gigo-Benato et al. (Brasil-Itália) 2003 Neurorrafia termino- lateral no nervo Ulnar n. mediano do rato InGa(Al)As (contínuo) InGaAs (pulsado) 808nm 905 nm 39s 1° dia pós-op., 3 dias por semana por 3 semanas (tot. = 9) Funcional morfológica positivo Che net al. 2005 Tubulização tubo- silicone (10 mm) n. ciático do rato As GaAl (pulsado) GaAs (pulsado) 905 nm 904 nm 72 s 2min Início 2°sem pós-op por 7 sem dias alternados Eletrofisiológica morfológica negativo Rochkind et al. (Israel) 2007 Tubulização PGA Neurotube (5 mm) n.ciático do rato (contínuo) 780 nm 5 min Por ponto (6 pontos) Total 30 min 14 dias consec .(tot. = 14) funcional eletrofisiológica morfológica positivo Mohammed et al. (Iraque) 2007 Neurorrafia termino- terminal n. fibular coelhos da Nova Zelandia GaAlAs diodo 901 nm 10 min 1° dia pós-op.,por 10 dias consec.(tot. = 11) Morfologia Morfometria Positivo Wu et al. (Estados Unidos) 2009 Hemisecção dorsal Contusão dorsal Medula T9/10 ratos diodo 810 nm 2,997 s 15 min após lesão por 14 dias consec.(tot. = 15) Morfologia Marcação retrógrada Funcional Teste de campo aberto Positivo Tabela 1. Principais características dos principais estudos. 11 2. OBJETIVO Analisar a regeneração do nevo isquiático de ratos, em lesões moderadas (axoniotmese) e graves (neurotmese) , sob ação do laser de baixa intensidade, com comprimentos de ondas de 660 nm e 780 nm, com potencia fixa de 40mW, em diferentes densidades de energia de 10 J/cm², 60 J/cm² e 120 J/cm2. 12 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Animais Neste estudo foram utilizados ratos, albinos, Wistar (Rattus norvegicus), adultos (275 g), num total de 128 animais divididos em 16 grupos. Os animais foram mantidos ao longo de todo o experimento em gaiolas individuais, com comida e água ad libitum, e ambiente com temperatura e luminosidade controlada. O experimento foi conduzido segundo as normas internacionais de ética na experimentação animal e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal UFSCar (Parecer n° 001/06). 3.2. Procedimentos Cirúrgicos Os animais foram previamente pesados e submetidos à anestesia geral (quetamina 95 mg/kg e xilazina 12 mg/kg). Foi realizada a tricotomia e assepsia na face posterior do membro inferior direito dos animais. Foram posicionados em decúbito ventral. Em seguida, foi feito o afastamento dos músculos glúteo médio e mínimo para produzir uma abertura longitudinal na face posterior da coxa, com aproximadamente dois centímetros de comprimento, para visualização do nervo ciático. 3.2.1. Protocolo de lesão por esmagamento Para criar uma lesão reproduzível e padronizada, foi utilizada uma pinça que exerceu uma força de 54 N por um período de 30 s, ao longo de 3 mm do comprimento do nervo ciático, 10 mm acima da sua bifurcação (BEER, STEURER & MEYER, 2001; VAREJÃO, 2004). A pinça era introduzida dentro da cavidade e era feita a pressão sem tracionar o nervo. A B Figura 1. Procedimento de lesão de esmagamento. A) Pinça de Pressão padronizada 54N, esmagando o nervo ciático. Foto meramente ilustrativa, para exposição do nervo para a foto. B) Nervo ciático aproximadamente 30 segundos após esmagamento. 13 3.2.2. Protocolo de lesão término-terminal O nervo ciático sofreu um corte transversal ao seu eixo e após a neurotmese o coto proximal do nervo foi suturado ao coto distal com um fio de sutura monofilamento 8.0. A sutura foi realizada na região do epineuro dos nervos. Esse procedimento microcirúrgico foi realizado através da visualização por lupa cirúrgica com ampliação de quatro vezes. Durante ambos os procedimentos cirúrgicos, o campo da cirurgia foi mantido úmido com solução fisiológica a 0,9 %. Após a lesão do nervo o músculo glúteo foi suturado com fio monofilamento de nylon 6.0 e a pele com fio de sutura 4.0. Após a cirurgia os animais foram colocados isoladamente em gaiolas e alimentados com comida e água ad libitum. Por quatro dias foi adicionado à água Paracetamol 750mg (13,5 mg/100 ml) para a redução da dor. Uma dose única de antibiótico terramicina (1mg/0,1mL) foi administrada para evitar complicações secundárias referentes a possíveis infecções. Figura 2. Cirurgia Neurorrafia termino-terminal. Foto ilustrativa da cirurgia, a sutura é somente na região epineural. 14 3.3. A Laserterapia (Aplicação do Laser) A estimulação a laser foi realizada com o laser de baixa intensidade (GaAlAs e AsGaIn), devidamente calibrado e aplicado com emissão contínua transcutânea pontual, tanto o comprimento de 660 nm quanto o de 780 nm com potência fixa de 40 mW. A área do feixe era de 0,04 cm2. O tempo de aplicação por ponto variou de acordo com a densidade de energia aplicada, ilustrada na figura 3. Comprimento de Onda Potência Fixa para todos Densidade de energia Energia total emitida por ponto Tempo de emissão em minutos 660 nm 40 mW 10 J/cm2 4 J 1/2 660 nm 40 mW 60 J/cm2 24 J 1 660 nm 40 mW 120 J/cm2 48 J 2 780 nm 40 mW 10 J/cm2 4 J 1/2 780 nm 40 mW 60 J/cm2 24 J 1 780 nm 40 mW 120 J/cm2 48 J 2 Para evitar variabilidade no manuseio, todos os animais operados foram estimulados manualmente tanto na aplicação simulada quanto na do laser. Os animais não foram anestesiados nos procedimentos terapêuticos. Um pano escuro era colocado no dorso do animal cobrindo sua face até o quadril, a mão do aplicador ficava posicionada sobre o pano, para imobilização do animal. Deste modo, era aplicado o laser na região da lesão. 3.3.1. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Axoniotmese Aplicação foi realizada diariamente por 10 dias consecutivos, a partir do primeiro dia do pós- operatório, em dois pontos ao longo do nervo ciático (dois centímetros de distância entre eles), um na região mais proximal, e o outro ponto na região mais distal da lesão. Os ratos foram tricotomizados antes de todas as aplicações do laser. Os ratos não tiveram tratamento por 19 dias. Figura 3. Parâmetros de aplicação do laser. Energia por ponto = dose (J/cm2) x área do spot (cm2). 15 3.3.2. Protocolo de Aplicação do Laser Pós-Neurorrafia Término-terminal Aplicação foi realizada diariamente por 10 dias consecutivos, a partir do primeiro dia do pós-operatório, em dois pontos ao longo do nervo ciático (dois centímetros de distância entre eles), um na região mais proximal, e o outro ponto na região mais distal da lesão. Após o décimo primeiro dia foi iniciada a aplicação do laser em dias alternados por um mês. Depois do tratamento eles ficaram 43 dias sem aplicação do laser. 3.4. Grupos Experimentais Os grupos experimentais foram chamados somente como “J” somente para abreviar o nome dos grupos apresentados e discutidos nesse trabalho. Portanto o “J” nos grupos representa J/cm2. Os grupos animais foram divididos em 16 e tiveram 8 animais por grupo (n:8): Grupos experimentais: 1.Com lesão de esmagamento (Crush – CR) do nervo 1. a) N Normal 1. b) Crush (CR) axoniotmese 1. c) CR 660 + 10 J/cm² 1. d) CR 660 + 60 J/cm² 1. e) CR 660 + 120 J/cm² 1. f) CR 780 + 10 J/cm² 1. g) CR 780 + 60 J/cm² 1. h) CR 780 + 120 J/cm² 2. Com neurorrafia término-terminal 2. a) N Normal 2. b) Término-Terminal (TT) 2. c) TT 660 + 10 J/cm² 2. d) TT 660 + 60 J/cm² 16 A B C D 2. e) TT 660 + 120 J/cm² 2. f) TT 780 + 10 J/cm² 2. g) TT 780 + 60 J/cm² 2. h) TT 780 + 120 J/cm² 3.5. Avaliação Funcional A avaliação da recuperação nervosa calculada pelo índice funcional do ciático (SFI) que foi descrito por Bain, Mackinnon & Hunter (1989). Os animais foram treinados, três vezes seguidas, a caminhar em um corredor que mede 42 cm de comprimento e 8,2 cm de largura. Após o treino, um papel branco colocado no assoalho do corredor possibilitou o rato caminhar sobre ele e registrar suas pegadas das patas posteriores, previamente coradas com tinta de carimbo. As mensurações foram feitas pelo mesmo avaliador por meio de uma régua. Três medidas foram obtidas a partir das impressões destas patas (1) PL= distância do 3º dedo ao calcâneo; (2) TS = distância do 1º ao 5º dedo; (3) ITS = distância do 2º ao 4º dedo. Após todas as medidas feitas tanto na pata experimental (E) quanto na normal (N) o índice funcional do ciático foi calculado de acordo com a equação proposta por Bain, Mackinnon & Hunter (1989) : Figura 4. Análise funcional da marcha do rato. A) Marca de uma pata de rato, e como são feitas as medidas. B) Representação em uma pata natural de um animal. C) A execução do teste. D) Fórmula numérica para aquisição do índice funcional do ciático. Varejão et al., 2004 17 3.6. Avaliação Morfológica e Imunofluorescência Após 30 dias (para os grupos axoniotmese) e 84 dias (para o grupo neurorrafia término- terminal) da intervenção cirúrgica, os nervos ciáticos reparados foram isolados e removidos dos animais sob anestesia total, assim como os músculos tibiais anteriores (TA), inervados pelo nervo ciático, analisados para avaliar a recuperação do trofismo muscular. Para o estudo com axoniotmese, quatro nervos foram imediatamente congelados imediatamente em nitrogênio líquido e armazenados em freezer -86ºC; outros quatro foram usados para a análise morfológica. Após a dissecação dos tecidos os animais foram eutanasiados com overdose de anestésico. Já para o estudo com neurotmese, oito nervos foram usados para a análise morfológica e morfométrica. Para a análise morfológica tem-se então: cada nervo (parte distal) foi dividido transversalmente em dois segmentos. Um foi fixado em glutaraldeído e incluído em resina, para análise morfométrica, o outro foi fixado em praformaldeído e incluído em parafina, para análise de imunofluorescência. Para a inclusão em historesina e em parafina, foram utilizados os procedimentos de rotina. Basicamente para a inclusão em parafina, os nervos foram fixados em formol 10% em uma hora e armazenados em álcool 70%, foram desidratados e posteriormente inclusos em parafina. Cortes transversais de 7 µm de espessura, paralelos ao eixo transversal do nervo, foram feitos em um micrótomo da marca ANCAP. Para a inclusão em historesina os nervos foram fixados em glutaraldeído 25% durante sete horas e armazenados em tampão sacarose e azida sódica. Antes de serem inclusos em historesina os nervos foram impregnados com Tetróxido de ósmio á 2%. Posteriormente, os nervos foram cortados transversalmente com 3 µm de espessura. Para a observação dos grupos esmagados os cortes foram corados com azul de toluidina. Para análise de imunofluorescência, os cortes foram incubados por uma noite em solução contendo anticorpo anti-S100 (policlonal produzido em coelho, com lócus de reconhecimento da unidade monomérica para S-100 cálcio-englobando a proteína 21 KD bovina, diluição 1:800, Sigma, St Louis, MO, USA) capaz de identificar mielina e células de Schwann. Após lavagem em PBS, os cortes foram encubados por uma hora contendo o anticorpo secundário TRITC-conjugado IgG anti-coelho (diluição de 1:200, Dako). Os cortes foram montados para análise em microscópio 18 de fluorescência. As imagens foram obtidas no microcópio Axiolab (Carl Zeiss, Jena, Alemanha) e as fotos foram feitas no aumento da objetiva de 100x com a câmera HRc Carl Zeiss AxioCam. 3.7. Avaliação Morfométrica das Fibras Nervosas Regeneradas Para análise morfométrica das fibras nervosas regeneradas, foi utilizado o método do Systematic Random Sampling e do 2D-Dissector que foi descrito por Geuna ,Gigo-Benato & Rodrigues (2004). As lâminas foram analisadas no microscópio Olympus CBA-K. As imagens foram feitas, a 100x com a câmera Digital color SCC-131A Samsung e capturadas com o programa Honestech Tvr 2.5. Para a histomormometria foram feitas 12 imagens por nervo, seguindo um rigoroso esquema de escolha do campo, depois essas imagens foram analisadas no programa: Image J Launcher versão 1.41 (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA / http://rsb.info.nih.gov/ij). As medidas realizadas foram: número de fibras nervosas por campo, área de secção transversa do axônio, da bainha de mielina e da fibra nervosa. Os dados numéricos foram analisados por meio do programa MATLAB. 3.8. Avaliação do Músculo Os músculos TA direitos foram divididos em duas porções a partir do ventre muscular, um fragmentado proximal foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido para a zimografia. O fragmento distal foi congelado em isopentano pré resfriado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer -86ºC. Foram realizados cortes histológicos seriados (10 μm), na porção média do músculo, em micrótomo criostato a -25ºC. Estes cortes foram corados com azul de toluidina (TB) para análise da área de secção transversa das fibras musculares. Os músculos foram corados com Trinômio de Masson para análise morfológica geral sobre a estrutura muscular entre os diferentes grupos. A morfometria da área de secção transversa das fibras musculares foi medida em microscopia de luz, usando o software Axion Vision (Carl Zeis). A área de secção transversa de duzentas fibras musculares, escolhidas aleatoriamente de cada músculo TA, foi mensurada a partir da imagem obtida da região central do ventre muscular. 19 3.9. Análise zimográfica A zimografia é uma técnica que utiliza gelatina como substrato em gel de SDS-PAGE, permitindo verificar a atividade gelatinolítica de proteases teciduais. Neste caso, pretendemos observar a atividade de MMPs, que são fortemente ativas durante processos de adaptação muscular, sendo responsáveis, em grande parte, pelo processo de remodelamento do tecido conjuntivo do músculo e do nervo. Fragmentos musculares e nervos congelados (25 mg) foram lavados 3 a 4 vezes com salina gelada e incubados com o tampão de extração (ácido cacodílico 10 mM pH 5,0, NaCl 0,15 mM, ZnCl2 1 μM, CaCl2 20 mM, NaN3 1,5 mM e Triton X-100 0,01% [v/v]) a 4oC, com agitação contínua, durante 24 horas. As amostras foram então centrifugadas a 13000 rpm e o sobrenadante coletado. 3.9.1. Dosagem de proteínas A concentração de proteínas dos nervos e dos músculos foi determinada utilizando-se o kit BCATM Protein Assays (Pierce), segundo instruções do fabricante. Esse método é baseado no ácido bicinconínico (BCA) para detecção colorimétrica e quantificação de proteínas totais. Foi construída uma curva padrão baseada nas concentrações de 25 µg/ml a 2000 µg/ml de BCA. As absorbâncias da curva padrão e das amostras de interesse foram lidas a 562 nm e a concentração protéica foi estimada a partir delas. 3.9.2. Zimografia O extrato tecidual foi então testado quanto à presença de atividade gelatinolítica, conforme descrito por Cleutjens et al (1995). Duplicatas de amostras foram eletroforisadas em gel de SDS- PAGE com gelatina (100 mg/ml). Após a eletroforese, o gel foi lavado 2 vezes durante 30 minutos em solução 2,5 % de Triton X-100 para remoção do SDS. Em seguida, separaram-se as duplicatas, cortando-se o gel. Uma metade do gel foi incubada em tampão de substrato (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, CaCl2 5 mM e NaN3 0,02%). A outra metade foi incubada no mesmo tampão contendo EDTA (15 mM), para verificar se a protease é um metaloprotease, uma vez que o EDTA inibe sua atividade. Ambas as metades foram incubadas a 37º C, durante 24 horas. Após este tempo, o gel foi corado com Coomassie Blue por 30 minutos, descorado com ácido acético:metanol:água (1:4:5) para visualização das bandas de atividade. Para documentação, o gel foi fotografado e as bandas de atividade foram analisadas quanto sua densitometria no software Gene Tool da Syngene. 20 3.10. Avaliação Estatística dos Dados Os dados foram submetidos aos testes de Levene e Shapiro-Wilk para avaliar a homogeneidade e normalidade das amostras, respectivamente. Para dados paramétricos, os testes Anova one-way seguido por Tukey foram utilizados para identificar e localizar as diferenças, respectivamente. Para dados não paramétricos, Kruskal-Wallis seguido por Newman-Keuls foram utilizados. Um nível de significância de 5% foi adotado. 21 4. RESULTADOS 4.1. Grupos com esmagamento do nervo 4.1.1. Teste Funcional As figuras 5 e 6 mostram os resultados da avaliação funcional da recuperação pós-traumática do nervo ciático dos grupos que foram operados com a técnica de esmagamento, calculada por meio do índice funcional do ciático. No momento pré-cirúrgico, todos os grupos estavam normais e seus valores foram semelhantes e próximos à zero. No primeiro dia após a cirurgia, como era esperado, ocorreu uma queda significativa do índice de todos os grupos experimentais. Os índices se mantiveram baixos até o 12° dia, após esse período os grupos aproximaram-se dos níveis considerados normais. Portanto a análise estatística ANOVA mostrou a diferença mais evidente no momento pré-cirurgia, que foi quando os nervos ainda estavam normais, em comparação com o pós-cirúrgico e a pré-eutanásia. Todas as avaliações entre os grupos, em todos os momentos estudados, não detectaram mudanças entre os sete grupos (p>0,05). 22 Figura 5. Resultado do teste funcional CR660nm. Análise funcional da marcha, dos grupos dos nervos esmagados e tratados com o laser 660 nm. CR crush. Medidas realizadas antes da lesão do nervo, e em dias alternados. * Diferença estatística significante (p <0,05). Os números de 2° ao 28° são os dias que foram realizados o teste funcional pós-lesão. Valores normais entre 0 á -20. J = J/cm2. Figura 6. Resultado do teste funcional CR780nm Análise funcional da marcha, dos grupos dos nervos esmagados e tratados com o laser 780 nm. CR controle lesado. Medidas realizadas antes da lesão do nervo, e em dias alternados. * Diferença estatística significante (p <0,05). Os números de 2° ao 28° são os dias que foram realizados o teste funcional pós-lesão. Valores normais entre 0 á -20. J = J/cm2 23 4.1.2. Histologia dos músculos Tibiais Anteriores (TA) A análise histológica por Tricrômio de Masson dos músculos TA mostrou uma atrofia das fibras musculares dos grupos CR e CR780 10, 60 e 120J comparados ao grupo N e CR660 10, 60 e 120J (Fig. 7). Esta atrofia pode ser observada pela redução da área de secção transversa das fibras musculares. A forma poligonal das fibras musculares foi preservada em todos os grupos experimentais (Fig. 7). Os grupos submetidos à lesão nervosa periférica apresentaram um aumento da produção de colágeno total principalmente no perimísio que recobre os feixes de fibras musculares (Fig. 7). Fibras musculares alvo foram encontradas próximas às terminações nervosas em todos os grupos com lesão nervosa periférica. Estas fibras alvo são um indicativo que o processo de reinervação está ocorrendo. As fibras musculares alvo apresentam sinais morfológicos de reorganização da sua citoarquitetura, pois possuem uma região central arredondada com filamentos desorganizados (Fig. 7). 24 Figura 7 Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais corados com Tricrômio de Masson. Observe que os grupos CR e CR780 10, 60 e 120J apresentaram atrofia das fibras musculares em relação ao N. Cabeças de setas indicam aumento de colágeno total no perimísio dos grupos submetidos à lesão nervosa periférica. Setas indicam a presença de fibras alvo, sendo um indicativo de reinervação destas fibras. Asterisco (*) mostra uma terminação nervosa intramuscular. J = J/cm2.. Escala da barra=20µm para todos os grupos, na última a figura abaixo à direita 50µm. 25 4.1.3. Área de Secessão transversa (AST) das fibras musculares A AST das fibras do músculo TA diminuiu significativamente nos grupos CR e CR780 comparados ao grupo N (P<0,05; Fig. 8). No grupo CR houve uma redução média de 55,11% comparado a N (P<0,05; Fig. 8). Os grupos irradiados com laser 780 nm apresentaram uma diminuição média de 44,47% na AST das fibras musculares (CR780 10J: -37,01%; CR780 60J: -51,77%; CR780 120J: -44,63%) comparados ao N (P<0,05; Fig. 8). Os valores de AST das fibras musculares nos grupos irradiados com laser 660 nm não diferiram entre si e foram semelhantes aos valores normais (P>0,05; Fig. 8). 4.1.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA A MMP-9 não foi detectada nos músculos TA em nenhum dos grupos experimentais. A atividade da MMP-2 no grupo CR não diferiu dos valores normais (p>0,05; Fig. 9). O laser com comprimento de onda de 660 nm nas diferentes doses (10, 60 e 120J) diminuiu significativamente a atividade da MMP-2 quando comparado ao grupo N (p<0,05; Fig. 9). Além disso, tanto CR660 10J quanto CR660 60J também apresentaram valores significativamente menores na atividade de MMP-2 se comparados ao CR (p<0,05; Fig. 9). Figura 8.. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais. *p<0,05 comparado ao N. Note que a irradiação à laser 660nm acelerou a recuperação da AST das fibras musculares independente da intensidade de energia aplicada. J = J/cm2 26 Os grupos CR780 60J e CR780 120J apresentaram uma diminuição de atividade da MMP- 2 em comparação ao N e ao CR (p<0,05; Fig. 9). A atividade da MMP-2 em CR780 10J não diferiu dos grupos N e CR (p<0,05; Fig. 9). 4.1.5. Análise histológica do Nervo Ciático A figura 10 mostra a histologia dos nervos ciáticos corados com azul de Toluidina, de todos os grupos lesados e também do grupo normal, que ilustram claramente similaridade de organização estrutural em todos os grupos. Uma leve diminuição da AST da fibra pode ser observada em todos os cortes dor nervos que foram esmagados em comparação ao grupo normal. Esta leve atrofia pode ser observada mais evidente nos dois últimos grupos CR780 60J e 120J. Os nervos dos grupos que foram tratados com o laser 660 nm nas três densidades de energia (10, 60 e 120 J/cm2) e o grupo CR780 10 J mostraram-se mais estruturados com as fibras nervosas maiores comparados ao CR. A figura 11 mostra um nervo marcado com anti-S100. Esta técnica nos possibilitou observar a bainha de mielina e células de Schwann ao redor do axônio. No grupo N foi Figura 9. Atividade total da MMP2 nos grupos CR. A Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. *P<0,05: comparado ao N; †P<0,05: comparado ao CR. Observe a expressiva diminuição da atividade da MMP-2 nos grupos CR irradiados com laser 660 nm, em doses baixas (10J); ou moderadas (60J). Observe os irradiados com laser 780 nm; em doses moderadas (60J) ou elevadas (120J), comparado aos grupos N e CR. Bandas representativas da atividade gelatinolítica da MMP-2 são apresentadas na parte superior do gráfico. J = J/cm2 27 possível observar a organização das fibras nervosas, a bainha de mielinha bem evidenciada na cor vermelha. Já nos grupos experimentais foi observada uma expressão similar de S-100 entre os grupos com axoniotomia, indicando um processo de regeneração e reestruturação da fibra nervosa. Não houve diferenças aparentes entre os grupos com lesão nervosa periférica. 28 Figura 10. Cortes histológicos dos nervos axoniotmisados, corados com azul de toluidina. Seta representa a fibra nervosa mielinisadas. Escala da barra 100µm. J = J/cm2 29 Figura 11. Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com anti-S100. Observe a bainha de mielina em vermelho. Cabeça de seta representa a estrutura normal da bainha de mielina; Seta mostra o padrão de expressão de S-100 nos grupos axoniotomizados. Escala da barra 100µm. J = J/cm2 30 4.1.6. Análise Morfométrica do Nervo Ciático 4.1.6.1 Número de Fibras por campo O valor médio de fibras nervosas por campo foi de 135 ± 27, sendo que não houve diferença entre o número de fibras nervosas entre os diferentes grupos experimentais (P>0,05; Fig. 12). 4.1.6.2. Área de secção transversa (AST) da mielina, axônio e fibras nervosas. A figura 13 mostra os valores de AST das mielinas, dos axônios e das fibras nervosas nos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Para a mielina, foi observada uma redução na AST nos grupos CR, CR660 120J e CR780 60J comparados a N (P<0,05, Fig. 13). Os grupos CR660 10 e 60J e CR780 10 e 120J apresentaram valores de AST de mielina semelhante ao grupo N (P>0,05; Fig.13). Para o axônio, observou-se uma diminuição na AST de todos os grupos com lesão nervosa periférica, comparados a N (P<0,05; Fig. 13). Não houve diferença entre os grupos experimentais lesados (P>0,05; Fig.13). O comportamento da AST da fibra nervosa acompanhou as alterações da mielina, isto é, os grupos CR660 10 e 60J e CR780 10 e 120J apresentaram valores similares ao grupo N (P>0,05; Fig.13), enquanto que Figura 12. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Não houve diferença entre todos os grupos. 31 CR, CR660 120J e CR780 10 e 120J tiveram seus valores de AST reduzidos quando comparados ao grupo N (P<0,05; Fig.13). 4.1.7. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no nervo ciático A lesão nervosa não modificou a atividade da MMP-9 no grupo CR comparado ao N (p>0,05). A irradiação com laser 660 nm, independente da dose utilizada, diminuiu a atividade da MMP-9 nos nervos ciáticos lesados comparados ao CR (CR660 10J: -62%, p=0,0002; CR660 60J: -68%, p=0,0001; e CR660 120J: -39%, p=0,03; Fig. 14). O grupo CR780 10J apresentou uma redução significa da atividade da MMP-9 comparada ao N e ao CR (p=0,02 e p=0,0001, respectivamente; Fig.14). Os grupos CR780 60 e 120J apresentaram atividade de MMP-9 semelhante aos grupos N e CR (p>0,05. Fig.14). Figura 13. Área de secção transversa das bainhas de mielina, dos axônios e das fibras nervosas em nervo ciático dos diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao N. Observe que os grupos CR660 10 e 60J e CR780 10 e 120J apresentaram valores de AST de mielina e fibra nervosa similares ao N. Todos os grupos diminuiriam a AST do axônio comparados ao N. J= J/cm2. 32 A atividade da MMP-2 não foi alterada nos grupos CR e CR780 10, 60 e 120J comparada ao grupo N (p>0,05; figura 15). No entanto, todos os grupos irradiados com laser 660 nm tiveram a atividade da MMP-2 significativamente aumentada, se comparado ao grupo N (CR660 10J: +81%, p=0,04; CR660 60J: +126%, p=0,003; e CR660 120J: +100%, p=0,02) e CR (p<0,05; figura 15). Figura 14. Atividade total da MMP-9 observada nos diferentes grupos experimentais.*p<0,05: comparado ao grupo N; †p<0,05: comparado ao CR. Observe que todos os grupos irradiados com laser 660 nm e apenas o grupo CR780 10J, apresentaram uma diminuição da atividade de MMP-9 comparada ao CR. Bandas representativas da atividade gelatinolítica da MMP-9 são apresentadas na parte superior do gráfico.J= J/cm2. 33 4.2. Grupos neurorrafia Término-Terminal 4.2.1. Teste Funcional Todos os grupos experimentais apresentaram valores similares ao N (P>0,05; Fig. 16) no momento prévio à cirurgia (pré-TT). No entanto, já no primeiro dia todos os grupos TT, irradiados ou não com laser, apresentaram valores médios em torno de -117. Estes valores não diferiram entre si, mas foram inferiores aos seus valores pré-TT (P<0,05; Fig.16). No quarto dia, houve uma diferença entre os grupos TT660 10J e TT780 60J, eles aumentaram em comparação ao TT (P<0,05). Todos os grupos foram melhores que TT no décimo sexto dia (P<0,05). No vigésimo quinto dia, os grupos TT660 60 e 120J e os grupos TT780 60 e 120J apresentaram valores significativamente maiores que o grupo TT (P<0,05). Os grupos TT660 120J e todos os grupos TT780 foram melhores que o grupo TT no trigésimo sétimo e no quadragésimo nono dias (P<0,05). Além disso, no dia 49 TT660 10J também teve um desempenho melhor que TT (P<0,05). No dia 61, os grupos TT660 10J e TT780 60 e 120J foram melhores que o TT. No final do experimento, todos os grupos experimentais lesados Figura 15. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. *p<0,05: comparado os grupos N e CR. Observe o aumento significativo da atividade da MMP-2 nos grupos irradiados com laser 660nm comparado ao N e CR. Bandas representativas da atividade gelatinolítica da MMP-2 são apresentadas na parte superior do gráfico.J= J/cm2. 34 estavam menores que na pré-lesão (P<0,05; Fig.16), não houve diferenças significativas entre eles ao final do experimento (P>0,05; Fig.16). 4.2.2. Histologia dos músculos TA Cortes transversais dos músculos TA mostraram atrofia das fibras musculares nos grupos TT, TT660 10J, TT780 60J e TT780 120J quando comparados ao N (Fig.17). Estas fibras apresentaram uma forma arredondada diferente da forma poligonal da fibra muscular normal (Fig.16). Todos os grupos lesados apresentaram fibras musculares anguladas, algumas fibras com núcleos centralizados e degeneradas (Fig.17). Os grupos TT660 60J, TT660 120 e TT780 10J apresentaram fibras musculares com a arquitetura bem preservada e diâmetro aparentemente similar ao grupo N (Fig.17). Figura 16.. Índice funcional do nervo ciático nos diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao Pré-TT e ao N. Observe que já no primeiro dia, todos os grupos submetidos à cirurgia diminuíram seus índices indicando uma piora da função. Esta diminuição manteve-se até o final do experimento. Todos os grupos TT não alcançaram seus valores Pré-lesão (normais). Valores normais entre 0 á -20. J= J/cm 35 Figura 17. Cortes histológicos transversais do ventre dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais corados com Azul de Toluidina. Observe que os grupos TT, TT660 10J, TT780 60J e TT780 120J apresentaram atrofia das fibras musculares em relação ao N. As fibras musculares destes grupos apresentaram uma forma arredondada característica de fibras desnervadas. Os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J possuíam fibras musculares com arquitetura mais preservada. Em todos os grupos com TT irradiados ou não com laser foram observadas fibras anguladas (setas), fibras musculares com núcleos centralizados (cabeça de seta) e fibras em degeneração. J= J/cm2. 36 4.2.3. Área de secção transversa (AST) das fibras musculares A AST das fibras musculares diminuiu significativamente nos grupos TT (-41%, p = 0,0001), TT660 10J (-20%, p = 0,09), TT780 60 (-24%, p = 0,04) e 120J (-31%, p = 0,002) comparados ao grupo N (Fig. 18). Os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J apresentaram valores da AST das fibras musculares semelhantes ao N (P>0,05; Fig.18) e superiores ao TT (TT660 60J: p = 0,005; TT660 120J: p = 0,01; e TT780 10J: p = 0,02, respectivamente; Fig.18). 4.2.4. Atividade total de matriz metaloproteinases (MMPs) no músculo TA A MMP-9 não foi observada nos músculos TA nos grupos experimentais examinados. A atividade da MMP-2 no grupo TT não diferiu dos valores normais (p>0,05; Fig. 19). O laser com comprimento de onda de 660 nm nas diferentes doses (10, 60 e 120J) diminuiu significativamente a atividade da MMP-2 quando comparado ao grupo N e TT (p<0,05; Fig. 18). Não houve diferença entre os grupos TT660 (P>0,05; Fig.19). A atividade da MMP-2 foi significativamente menor no grupo TT780 10J quando comparada ao TT (P<0,05; Fig.19), já o grupo TT780 60J apresentou atividade semelhante ao Figura 18. Área de Secção Transversa (AST) dos músculos TA dos diferentes grupos experimentais. *p<0,05: comparados ao N; †P<0,05: comparado ao TT. Note que os grupos TT660 60 e 120J e TT780 10J apresentaram valores normais da AST das fibras musculares.J= J/cm2 37 N e ao TT (P>0,05; Fig.19). Além disso, o grupo TT780 120J teve a atividade total de MMP- 2 aumentada se comparada ao N e TT (P<0,05; Fig..19). 4.2.5. Histologia do nervo ciático 4.2.5.1. Análise histológica do Nervo Ciático A figura 20 mostra a histologia dos nervos ciáticos impregnados com tetróxido de ósmio em todos os grupos lesados e também do grupo normal que ilustram claramente a diferença de organização estrutural de todos os grupos lesados em comparação ao normal. A figura do grupo N mostra suas fibras bem arredondadas e com a bainha de mielinha bem evidente. Já nos grupos experimentais as fibras não são todas arredondadas, com a presença de fibras achatadas e com a espessura tanto da fibra quanto da bainha de mielina menores do que as normais. Foi encontrado um grande número de células de Schwann englobando as fibras lesionadas. Figura 19. Atividade total da MMP-2 observada nos diferentes grupos experimentais. *p<0,05: comparado ao N; †p<0,05: comparado ao TT. Observe a expressiva diminuição da atividade da MMP-2 nos grupos TT660 10, 60, 120J e TT780 10J comparados ao N e TT. O grupo irradiado com laser 780 nm 120J apresentou um aumento na atividade total da MMP-2. J= J/cm2. 38 A figura 21 mostra um nervo marcado com anti-S100. Esta técnica nos possibilitou observar a bainha de mielina e células de Schwann ao redor do axônio. No grupo N foi possível observar a organização das fibras nervosas, a bainha de mielina bem evidenciada na cor vermelha. Já nos grupos experimentais foi observada uma diminuição da bainha de mielina, assim como a expressão de S100, comparados ao grupo normal. Todos os grupos experimentais neurotmizados não diferenciaram entre si. 39 Figura 20. Cortes histológicos dos nervos ciáticos, impregnados com tetróxido de ósmio. Escala da barra 100µm. J = J/cm2. Setas=Células de Schwann. 40 Figura 21. Cortes histológicos transversais dos nervos axoniotmisados marcados com anti-S100. Observe a bainha de mielina em vermelho. Cabeça de seta representa a estrutura normal da bainha de mielina; Seta mostra o padrão de expressão de S-100 nos grupos axoniotomizados. Escala da barra 100µm. J = J/cm2 . 41 4.2.6. Área de secção transversa do nervo ciático 4.2.6.1. Número de fibras nervosas O valor médio de fibras nervosas por campo foi de 132 ± 20, sendo que não houve diferença entre o número de fibras nervosas entre os diferentes grupos experimentais (P>0,05; Fig. 22). 4.2.6.2. Área de secção transversa (AST) de mielina, axônio e fibra nervosa. A figura 23 mostra os valores das AST das bainhas de mielinas, axônios e fibras nervosas nos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Para mielina, axônio e fibra nervosa observou-se uma redução na AST em todos os grupos TT, irradiados ou não com laser, comparados a N (P<0,05, Fig. 23). Apenas o grupo TT660 120J apresentou valores de AST da bainha de mielina e fibra nervosa superiores ao TT (P<0,05; Fig.23). Os demais grupos irradiados com laser 660 e 780 nm mostraram valores de AST para mielina e fibra nervosa semelhantes aos valores encontrados em TT (P>0,05; Fig.23). Todos os grupos TT apresentaram valores da AST dos axônios semelhantes entre si (P>0,05; Fig.23). Figura 22. Número de fibras nervosas por campo microscópico dos nervos ciáticos nos diferentes grupos experimentais. Não houve diferença entre todos os grupos. J= J/cm2. 42 Figura 23. Área de secção transversa da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa em nervo ciático dos diferentes grupos experimentais. *P<0,05 comparado ao N; †P<0,05 comparado ao TT. Observe que todos os grupos lesados apresentaram valores da AST da bainha de mielina, axônio e fibra nervosa inferiores aos valores normais. Apenas o grupo TT660 120J mostraram valores superiores da AST da bainha de mielina e fibra nervosa comparado ao TT. J= J/cm2. 43 5. DISCUSSÃO O presente estudo trouxe novas informações sobre os efeitos de doses diferentes da laseterapia na regeneração nervosa periférica e no músculo desnervado, em dois tipos de lesão do nervo ciático do rato. Todos os resultados trouxeram informações importantes para ajudar a esclarecer, determinar o melhor protocolo de aplicação do laser para acelerar a recuperação neuromuscular e consequentemente melhorar a sua função. A análise geral e em conjunto dos resultados será discutida, pois tanto os resultados dos músculos, quanto os dos nervos, tiveram uma tendência em demonstrar uma melhor resposta neuromuscular em determinadas doses do laser. Vários estudos realizados demonstram que o laser acelera o processo de regeneração do nervo (GIGO-BENATO, GEUNA & ROCHKIND, 2005; ANDERS et al., 2004). Porém, não foi encontrado nenhum estudo na última década que tenha analisado a reposta do músculo TA, pós-aplicação do laser, na lesão nervosa periférica (ROCHKIND et al., 2009 b;c). Outro ponto inovador desse estudo, que foi o pioneiro em estudar a atividade das MMPs no nervo esmagado e tratado com o laser. Além de estudar a atividade das MMPs no músculo TA pós-aplicação do laser na lesão nervosa periférica. Os resultados conflitantes sobre o uso da laserterapia podem ser resultantes de inúmeras variáveis técnicas (em particular o comprimento de onda, doses e tipos de irradiação) os quais se não forem adequadamente ajustados poderão reduzir o eventual sucesso do procedimento terapêutico (GIGO-BENATO, GEUNA & ROCHKIND, 2005). Seguindo essa necessidade de estabelecer protocolos clínicos de aplicação da laserterapia ainda não testados, esse estudo teve a intenção de continuar aprofundar a análise dessa irradiação sobre o nervo. Os principais aspectos que foram confrontados foram os tipos de comprimento de onda do laser, três parâmetros de irradiação e também dois tipos de modelos experimentais de lesões nervosas (neurotmese e axoniotmese), os quais são aspectos relevantes nas perspectivas de aplicação em pacientes. A escolha dos parâmetros do protocolo de irradiação do laser de baixa intensidade do presente estudo teve como base vários estudos científicos. Existe um aumento no uso dos aparelhos laser infravermelho, mas isso é justificado, pela sua maior penetração através da pele (TURNER & HODE , 1993). Efeitos positivos em estudos experimentais foram obtidos com comprimento de onda visível (ROCHKIND et al., 1987; HAMILTON et al., 1992; ANDERS et al., 1993) e próximo ao infravermelho (ROCHKIND et al., 2007 a;b; ROCHKIND et al., 2009 a). Parece que ambos os tipos de laser podem ser utilizados para promover a regeneração nervosa (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005). Outro 44 parâmetro é a densidade de energia, em que as análises dos resultados publicados mostraram que a laserterapia em diferentes níveis de densidade de energia, com menos de 10 J/cm² até 150 J/cm², são eficientes na regeneração nervosa (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005). O mesmo pode ser aplicado nos tempos de tratamento os quais oscilam de menos de 1 minuto até 90 minutos. Portanto, essas observações sugerem que a luz exerce um efeito positivo na regeneração nervosa, com uma grande variação de intervalos tanto de densidade de energia, quanto tempo de emissão. Todos os estudos publicados, os quais utilizaram emissão contínua levaram a resultados positivos. Portanto, esse tipo de emissão a laser de acordo com os protocolos observados, foi utilizado neste estudo baseados em achados na literatura (GIGO-BENATO,GEUNA & ROCHKIND, 2005). O presente estudo trouxe uma curva dose dependente, o qual foi essencial para conseguirmos encontrar uma dose mais adequada tanto ao tipo de lesão, quanto ao tipo de comprimento de onda utilizado. Nos grupos esmagados,parece que ambos os comprimentos de onda foram melhores para a área de secção transversa do nervo ciático. Porém, somente em algumas densidades de energia a atrofia da fibra nervosa periférica foi evitada, que foram no laser 660 nm nas densidades de energia 10 e 60 J/cm2 e no laser 780 nm na densidade de energia de 10 e 120 J/cm2. Nas mesmas doses foi observada que a espessura da bainha de mielina estava igual ao normal, este achado é um indicativo que o nervo pós-esmagamento e tratado com o laser nas doses acima mencionadas, melhorou sua atividade de condução. Porém na análise qualitativa de imunofluorescência a bainha de mielina e células de Schwann estavam marcadas, destacadas, porém não estavam diferentes do controle CR. A bainha de mielina é responsável pela condução do potencial de ação ao longo do axônio, e a falta ou redução dela no nervo causa uma diminuição ou perda da função axonal (OH, 2001). Já atrofia dos nos músculos TA foi evitada nos grupos experimentas que foram estimulados com o laser 660 nm, que se apresentaram sem atrofia muscular, comparados ao grupo lesado, isso sugere que suas funções estão normais, e que o laser 660 nm nas densidades de energia de 10, 60 e 120J/cm2 são eficazes em evitar a atrofia muscular do TA pós-lesão de axoniotmese. Os resultados relativos à atividade das MMPs no modelo de esmagamento nervoso, também são interpretados de acordo com o contexto global dos achados do músculo e do nervo. Deste modo, os autores do presente estudo acreditam que o laser 660 nm, principalmente os grupos 60 e 120 J/cm2, acelerou o processo de regeneração nervosa e reinervação das fibras musculares. Tal hipótese pode ser sustentada pelo fato que os grupos irradiados com laser 660 nm recuperaram a AST das fibras musculares comparados ao grupo normal e lesão. Esta recuperação foi acompanhada por um aumento da atividade da MMP-2 e 45 uma diminuição da MMP-9 no nervo. Já no músculo foi acompanhada por uma diminuição da atividade da MMP-2. Durante a degeneração walleriana, eventos iniciais como a desintegração do citoesqueleto axonal e a quebra da bainha de mielina são coordenados, dentre outros fatores, pela atividade das MMPs, especialmente a MMP-9 e -2. La Fleur e colaboradores (1996) mostraram que altos níveis de MMP-9 no 1º e 4º dia pós-lesão por esmagamento do nervo estão relacionados com o ingresso de neutrófilos e macrófagos, respectivamente. Os autores relatam ainda que estas células inflamatórias, e as células de Schwann, são capazes de secretar MMP-9. A secreção desta MMP é importante para gerar o remodelamento da matriz extracelular (MEC) que acompanha a destruição de débris de axônios e mielina, e assim permitindo o crescimento axonal. Além disso, a ação das MMPs é capaz de liberar as células de Schwann das suas conexões com a membrana basal, permitindo sua proliferação e estimulação das terminações axonais (LA FLEUR et al., 1996). Apesar do aumento da atividade da MMP-9 ser desejada em uma fase inicial da degeneração nervosa, a manutenção de seus níveis elevados pode ser prejudicial para a integridade tecidual. Beuche e colaboradores (2000) observaram um aumento de níveis séricos da MMP-9 em pacientes com esclerose lateral amiotrófica, possivelmente causado por nervos em degeneração e músculos desnervados. Ratos MMP-9-knockout que foram submetidos a uma lesão medular apresentaram uma recuperação acelerada da função motora comparados a animais não transgênicos (NOBLE et al, 2002). Juntos estes resultados indicam que a regulação negativa da MMP-9, pode ser um aspecto positivo durante fases finais do reparo neural. Ainda neste contexto, a produção de componentes da MEC como laminina, fibronectina e colágeno tipo IV pelas células de Schwann, é importante para auxiliar o crescimento axonal durante o processo regenerativo, pois formam uma espécie de rede para a passagem do cone de crescimento. Contudo, outros componentes da MEC como as proteoglicanas sulfato de condroitina (CSPG), são capazes de inibir este processo (GANTUS et al, 2006). Estudos prévios mostraram que, durante o processo de degeneração walleriana, o aumento da atividade da MMP-2 no nervo é capaz de reorganizar a lâmina basal via degradação de seu principal componente, o colágeno tipo IV, permitindo o avanço do cone de crescimento axonal (LA FLEUR et al, 1996). Além disso, já está bem descrito na literatura que a MMP-2 degrada proteoglicanas que inibem o processo de crescimento axonal como o sulfato de condroitina (GANTUS et al, 2006). Deste modo, o aumento da atividade da MMP-2 poderia ser um indicativo positivo do processo de degeneração/regeneração dos axônios. 46 Portanto, nossos resultados corroboram com tais achados, pois uma vez que grupos que apresentaram AST das fibras musculares iguais aos normais, e que apresentaram maior AST da bainha de mielina possuíam uma menor atividade de MMP-9 e maior de atividade de MMP-2 no nervo. Também é necessário destacar que estas MMPs são sistematicamente reguladas pelos inibidores teciduais de metaloproteinase (TIMP), controlando o processo e protegendo a estrutura da lâmina basal (LA FLEUR et al, 1996). Estudo futuros para investigar o papel do laser sobre as MMPs no tecido nervoso e muscular, devem também considerar os TIMPs. Em relação ao músculo esquelético desnervado, o papel das MMPs nestas situações ainda não está definido. Alguns estudos mostraram que o aumento da atividade da MMP-2 em músculos após 28 dias de desnervação pode estar relacionado com a atrofia muscular e a proliferação de tecido conjuntivo ao redor das fibras musculares (RUSSO et al., 2008), mas também com a abertura de canais para a reinervação das fibras desnervadas. Contudo, outros estudos mostram que o aumento da atividade da MMP-2 pode estar relacionado com ciclos de degeneração/regeneração das fibras musculares. Deste modo, a diminuição da atividade da MMP-2 nos músculos dos grupos irradiados com laser 660 nm, pode ter sido benéfica para o tecido muscular, pois poderia haver menos lesão. Estudos futuros deveriam avaliar os tecidos musculares e nervosos em diferentes períodos de tempo, para investigar o comportamento destas MMPs e assim confirmar estas hipóteses aqui geradas. Todos os animais experimentais que foram esmagados recuperam sua função normal ao final do experimento. Tal resposta já era esperada pelo tipo de lesão de esmagamento no nervo ciático do rato. Varejão e colaboradores (2004) usaram nosso mesmo protocolo de lesão de esmagamento no nervo ciático do rato, constataram que 4 semanas pós-lesão ocorreu recuperação de cerca de 80% da função, e que na 8° semana a recuperação motora dos animais era total. Portanto, no presente estudo a lesão no nervo ciático do rato (VAREJÃO et al., 2004) foi realizada mediante uma pinça com pressão padronizada (BEER, 2001). Esse é o modelo mais estudado na literatura (ROCHKIND et al 1987a;1987b; HAMILTON, KEVEN & RAY, 1992; ANDERS et al. 1993; KHULLAR et al.,1995; BAGIS et al.,2003; SHIN et al., 2003) por ser uma cirurgia rápida e por conseguir estudar os efeitos iniciais da recuperação nervosa. Mesmo sendo uma lesão com prognóstico de recuperação rápido em modelo animal, em humanos o tempo de recuperação de uma lesão traumática do nervo pode se estender vários meses ou até anos, dependendo do grau de severidade e de extensão da lesão (ROCHKIND et al., 2007 a;b). Pensando na aplicabilidade clínica é necessário estudar 47 terapias que acelere a recuperação do nervo lesado evitando vários problemas, como por exemplo, o tempo de imobilização que causa atrofia muscular. O laser foi eficaz em acelerar a regeneração do nervo pós-lesão severa em estudos que utilizaram comprimentos de onda similares e iguais aos aplicados no presente estudo (tab. 1) (ROCHKIND et al., 2007; MOHAMMED, AL-MUSTAWFI & KAKA., 2007; WU et al., 2009). Os resultados do nosso estudo, com lesão severa, ou seja, os neurotmesados, referente aos resultados da AST da bainha de mielina, foram todos iguais ao lesão TT. Com exceção no grupo TT660 120J que a bainha de mielina teve uma espessura igual ao normal. Os resultados da imunoflorescência não mostraram diferenças entre os grupos lesados. Em adição, é importante destacar que a AST da fibra dos músculos TA no grupo TT660 120J estava igual ao normal. Tais resultados reforçam a hipótese que o laser 660 nm na densidade de energia de 120 J/cm2 foi mais efetivo, em comparação as demais doses, dentro dos grupos dos submetidos à neurotmese. Em relação ao músculo TA, é importante salientar que a AST das fibras musculares nos grupos TT660 60J e TT780 10J apresentou níveis normais. Não é possível excluir a hipótese que talvez o laser 780 nm com densidade de energia de 10 J/cm2 possa exercer efeitos benéficos sobre a recuperação neuromuscular, pois níveis normais de AST das fibras musculares foram observados neste grupo. Achados interessantes em modelos animais e em humanos mostraram que o laser 780 nm é capaz de acelerar a regeneração nervosa periférica em lesões severas (ROCHKIND et al, 2007 a;b; ROCHKIND et al., 2009 a). Estudo em cultura de células neuronais de ratos estimuladas com o laser 780 nm, mostrou que esse comprimento de onda estimulou a migração de células neuronais, desenvolveu neurônios de maior calibre, com uma densa e ramificada rede de interligação de fibras nervosas (ROCHKIND et al.,2009 a). Parece que esse comprimento de onda também é eficaz em acelerar o prognóstico de recuperação em pacientes que sofreram lesões no nervo (ROCHKIND et al.,2007 a). A resposta funcional dos grupos experimentais ao longo dos 84 dias de pós-neurorrafia término-terminal foi muito variável. Entretanto, ao observarmos o grupo TT660 120J a partir do vigésimo dia, ele se manteve com sua função melhor em comparação ao controle TT, até o sexagésimo primeiro dia pós-lesão. Ao comparar esse achado funcional aos resultados da AST do nervo e do músculo TA, nesse grupo TT660 120J, é possível sugerir que o laser possa ter estimulado a regeneração do nervo, evitado a atrofia muscular e consequentemente melhorado a função neuromuscular. 48 Relativo a atividade das MMPs no músculo do experimento término-terminal, o laser 660 nm 60 e 120 J/cm2 e 780 nm 10 J/cm2 pode ter exercido um efeito benéfico sobre o tecido muscular, pois diminuiu a atividade da MMP-2 e acelerou a recuperação da AST das fibras musculares. Uma limitação do nosso estudo foi a ausência da análise da atividade total das MMPs do nervo. Devido ao número de amostras, o tempo de realização do experimento e a quantidade do tecido nervoso optamos por usar os nervos ciáticos para as análises histológicas e morfométricas a fim de evitar grandes variabilidades na amostra. Deste modo, consideramos que estudos futuros usem mais animais por grupo para evitar tais problemas. Apesar disso, acreditamos que mesmo na ausência das análises da atividade das MMPs no nervo, investigações futuras poderão focalizar e identificar as MMPs e os componentes da matriz extracelular, como laminina e colágeno IV. A neurotmese, como já foi anteriormente descrito na introdução, tem um prognóstico de recuperação mais lento. De Sá e colaboradores (2004) viram que em oito semanas a função do nervo na reparação término-terminal era de 80% e para que seja absoluta o autor sugere ainda algumas semanas. Contudo, estudos futuros deveriam estudar tempos pós-lesão e pós- tratamento superiores a 84 dias, ou talvez fazer uma curva de tempo, principalmente para as doses do presente estudo que apresentaram respostas positivas. O teste funcional utilizado em nosso estudo é muito difundido e utilizado, porque é de fácil execução, não invasivo e de baixo custo. Entretanto, a eficácia dos seus resultados é muito conflitante entre os cientistas. Alguns estudiosos aceitam o teste como uma boa ferramenta para avaliar o nervo ciático lesado, outros questionam sua acurácia, e sempre indicam testes mais precisos, como por exemplo, a vídeo análise (BEVAR, 2002; SARIKCIOGLU L, DEMIREL & UTUK et al.,2009, COSTA et al., 2009). Por mais que este teste funcional seja questionado, ele é uma análise adicional e que se observada em conjunto com outras análises, dá um respaldo á mais aos resultados dos tecidos analisados, dando uma visão global de como está à interação neuromuscular, assim como todo o segmento acometido. Com um adequado protocolo de aplicação da irradiação a laser, com lesões nervosas periféricas padronizadas, este estudo trouxe dados importantes para o uso clínico, tanto no comprimento de onda, densidade de energia, quanto no melhor protocolo de aplicação para cada tipo de lesão no nervo (axoniotmese ou neurotmese). Paralelamente aos resultados do presente estudo, chama a atenção para a necessidade de mais pesquisas sobre os efeitos da laserterapia na regeneração nervosa periférica, objetivando 49 uma definição mais clara sobre a parametrização, protocolos de irradiação do laser que sejam efetivos na promoção da recuperação nervosa pós-traumática. 50 6. CONCLUSÃO Este estudo teve como objetivo principal observar o efeito da laserterapia em seis protocolos de aplicação, em dois tipos de lesão do nervo ciático do rato. Ao observar os resultados em conjunto dos grupos que foram submetidos à axoniotmese é possível concluir que os protocolos de aplicação do laser 660nm 10, 60 e 120 J/cm2 mostrou ser efetivo na recuperação do nervo esmagado, evitou a atrofia do músculo tibial anterior, e ajudou no remodelamento da matriz extracelular do músculo tibial e do nervo ciático. Com base no objetivo proposto, podemos concluir que o grupo que foi submetido à neurotmese com o protocolo de aplicação do laser 660nm 120 J/cm2 mostrou ser efetivo na recuperação do nervo, evitou a atrofia do músculo tibial anterior, ajudou no remodelamento da matriz extracelular no músculo e sua função foi melhor em relação ao não tratado em quase todo o experimento. Na lesão grave, os protocolos de aplicação do laser 660nm 60, 120 J/cm2 e 780nm 10 J/cm2 exerceu um efeito benéfico no músculo tibial anterior, pois acelerou a área de secção transversa das fibras e ajudou no remodelamento da matriz extracelular. 51 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHTIKOSKI, A M TUOMINEN H, KORPELAINEN JT, TAKALA TE, OIKARINEN A. Collagen Synthesis and degradation in polyneuropathy and myopathies. Muscle Nerve. 30 (5):602-82, Nov 2004. AMAT A, RIGAU J, WAYNANT RW, ILEV IK, TOMAS J, ANDERS JJ. Modification of the intrinsic fluorescence and the biochemical behavior of ATP after irradiation with visible and near-infrared laser light. J Photochem Photobiol B.81(1):26-32, 3 Out 2005. ANDERS JJ, GEUNA S, ROCHKIND S. Phototherapy Promotes Regeneration and Functional Recovery of Injured Peripheral Nerve. Neurol Res. 26:233-239, 2004. ANDERS JJ, BORKE RC, WOOLERY SK, VAN DE MERWE WP. Low Power Laser Irradiation Alters The Rate of Regeneration of The Rat Facial Nerve. Lasers Surg Med. 13:72– 82,1993. AZZE R J, MATTAR Jr. R. Lesões dos Nervos Periféricos. In: Pardini Jr. AG, editor. Traumatismos da mão. 3a ed., Rio de Janeiro, Meds, 2000. BAGIS S, COMELEKOGLU U, COSKUN B, MILCAN A, BUYUKAKILLI B, SAHIN G, OZISIK S, ERDOGAN C. No Effect of GA-AS (904 nm) Laser Irradiation on the Intact Skin of the Injured Rat Sciatic Nerve. Lasers Med Sci.18:83– 88, 2003. BAIN JR, MACKINNON SE, HUNTER DA. Functional Evaluation of Complete Sciatic, Peroneal, and Posterior Tibial Nerve Lesions in the Rat. Plast Reconstr Surg. 83:129-138, 1989. BEER GM, STEURER J, MEYER VE. Standardizing Nerve Crushes with a Non-Serrated Clamp. J Reconstr Microsurg .17:531-534, 2001. BERVAR M. An alternative video footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. Acta Chir Plast. 44(3):86-9, 2002. BEUCHE W, YUSHCHENKO M, MÄDER M, MALISZEWASKA M, FELGENHAUER K, WEBER F. Matrix metalloproteinase-9 is elevated in serum of patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neuroreport.11:3419-3422, 2000. BILLINGTON L.; CARLSON B. M. The recovery of Long-Term Denervated rat muscles after Machine Treatment and Grafting. J neurol Sci. 144:147-155, 1996. CAVANAGH, J. B, WELLER, R. O. Peripheral Nervous system. Nervous System, Muscle and Eyes. London: Churchil Livingstone, 3. ed., v.4, cap. 11, p. 533-543,1990. CARMELI E, Moas M, Reznick AZ, Coleman R. Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve. 29:191–197, 2004. CHEN YS, HSU SF, CHIU CW, LIN JG, CHEN CT, YAO CH. Effect of Low-Power Pulsed Laser on Peripheral Nerve Regeneration in Rats. Microsurgery. 25:83– 89, 2005. 52 C.I. PLATT, C .A. KREKOSKI, R.V. WARD, D.R. EDWARDS, J. GAVRILOVIC. Extracellular Matrix and Matrix Metalloproteinases in Sciatic Nerve. Journal of Neuroscience Research. 74:417–429, 2003. COSTA LM, SIMÕES MJ, MAURÍCIO AC, VAREJÃO AS. Chapter 7: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-ki