UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA FUNCIONALIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO CARBON BLACK VULCAN XC–72R PARA APLICAÇÕES EM BIOSSENSORES BASEADOS EM INIBIÇÃO ENZIMÁTICA GLENDA GISELA IBÁÑEZ REDÍN* Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRA EM CIÊNCIAS, área de concentração: QUÍMICA ANALÍTICA. Orientador: Prof. Dr. Orlando Fatibello-Filho * bolsista CAPES São Carlos - SP 2016 Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária UFSCar Processamento Técnico com os dados fornecidos pelo(a) autor(a) I12f Ibáñez Redín, Glenda Gisela Funcionalização e caracterização do carbon black vulcan XC–72R para aplicações em biossensores baseados em inibição enzimática / Glenda Gisela Ibáñez Redín. -- São Carlos : UFSCar, 2016. 83 p. Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2016. 1. Carbon black. 2. Funcionalização. 3. Biossensores. 4. Inibição enzimática. 5. Tirosinase. I. Título. AGRADECIMENTOS À minha família pelo apoio e amor; Ao Camilo Akimushkin pelo apoio, compreensão e amor durante esta etapa; Ao Prof. Dr. Orlando Fatibello-Filho pela sua confiança, paciência e orientação; Ao Prof. Dr. Fernando C. Vicentini pela contribuição no desenvolvimento do trabalho e pelas discussões; Ao MSc. Tiago A. Silva pela sua contribuição, pelas discussões e pela sua colaboração na revisão do manuscrito; À MSc. Patrícia Deroco pela sua contribuição em alguns experimentos; Ao Prof. Dr. Ronaldo C. Faria e ao Prof. Dr. Bruno Campos Janegitz pelas discussões durante o seminário de mestrado; Aos membros do Laboratório de Solidificação, DEMA-UFSCar: Prof. Dr. José Eduardo Spinelli, MSc. David Gonzalez Cruz e MSc. Bismarck Luiz Silva pela colaboração nos experimentos sobre ângulo de contato; Aos Drs. Luiz Gorup e Ricardo Brocenschi pela colaboração em alguns dos experimentos; Aos meus companheiros de mestrado Marina Baccari, Elson Luiz Fava e Anderson Martins por toda ajuda e amizade; Aos membros do grupo de pesquisa LABBES; Aos professores do DQ-UFSCar por seus ensinamentos; Às secretárias da Pós-Graduação do Departamento de Química: Ariane, Cristina e Luciani pela colaboração; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior, CAPES pela bolsa concedida. iv LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária AuNPs – Nanopartículas de ouro (Gold nanoparticles) BSA – Albumina de soro bovino (Bovine serum albumin) CB – Negro de fumo (Carbon black) DHP – Dihexadecil hidrogenofosfato (Dihexadecyl hydrogen phosphate) CMC – Carboximetilcelulose (Carboxymethyl cellulose) DMF – Dimetilformamida ( N,N-Dimethylformamide) E – Enzima livre ΔEp – Separação entre os potencias de pico Epa – Potencial de pico anódico Epc – Potencial de pico catódico GCE – Eletrodo de carbono vítreo (Glassy carbon electrode) GO – Óxido de grafeno (Graphene oxyde) HPLC – Cromatografia liquida de alta eficiência (High performance liquid chromatography) GRAS – Substancias geralmente reconhecidas como seguras (Generally recognized as save) v I0 – Corrente na ausência do inibidor enzimático ID – Intensidade da banda D IG – Intensidade da banda G Ii – Corrente na presença do inibidor enzimático Is – Corrente do estado estacionário (Steady state current) IL – Liquido iônico (Ionic liquid) Ipa – Corrente de pico anódica Ki – Constante cinética de inibição enzimática KM app – Constante cinética aparente de Michaelis-Menten Kp – Constante cinética de formação de produtos Ks – Constante de formação do complexo enzima-substrato MEV – Microscopia eletrônica de varredura MWCNT – Nanotubos de carbono de parede múltiplas (Multiwall Carbon Nanotubes) NaBz – Benzoato de sódio P – Produto da reação enzimática PAMAN – Poliamidoamina (Polyamidoamine) S – Substrato da reação enzimática vi SPE – Eletrodos impressos (Screen-Printed Eletrode) vii LISTA DE TABELAS TABELA 3.1- Tratamentos das amostras de CB e nomenclatura empregada......... 26 TABELA 4.1- Comparação dos resultados da voltametria cíclica obtidos para diferentes eletrodos para uma solução de K3Fe(CN)6 1,0 mmol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 , v = 100 mV s −1 ................................................................................................... 38 TABELA 4.2- Resultados do estudo de velocidade de varredura de potenciais dos diferentes eletrodos em solução de K3Fe(CN)6 1 mmol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 e valores de área eletroativa (média das áreas eletroativas obtidas pelas curva de corrente de pico anódica e catódica) ........................................................................ 41 TABELA 4.3- Comparação dos parâmetros analíticos para diferentes biossensores de tirosinase .............................................................................................................. 53 TABELA 4.4-Valores de KM app para diferentes biossensores de Tyr ...................... 56 TABELA 4.5-. Efeito da concentração de enzima Tyr utilizada para preparação do biossensor sobre os parâmetros analíticos para a determinação de NaBz. Resultados extraídos das curvas da FIGURA 4.20 ..................................................................... 62 TABELA 4.6- Efeito da concentração de catecol sobre os parâmetros analíticos para a determinação de NaBz. Resultados extraídos das curvas da FIGURA 4.21 . 65 TABELA 4.7- Comparação das constantes de inibição para diferentes biossensores de Tyr utilizados na determinação de ácido benzoico. ........................................... 69 TABELA 4.8- Comparação dos parâmetros analíticos para diferentes biossensores de tirosinase na determinação de benzoato de sódio................................................ 72 viii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1.1-Componentes gerais dos biossensores enzimáticos. Adapatado de MOHANTY e KOUGIANOS 5 ................................................................................... 2 FIGURA 1.2-Tipos de imobilização enzimática. ....................................................... 3 FIGURA 1.3- Esquema do principio de funcionamento dos biossensores baseados na inibição enzimática. ............................................................................................... 4 FIGURA 1.4- Esquema do mecanismo de inibição competitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. .......................................................................................... 6 FIGURA 1.5-Esquema do mecanismo de inibição acompetitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. .......................................................................................... 7 FIGURA 1.6-Esquema do mecanismo de inibição não competitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. ....................................................................................... 8 FIGURA 1.7-Esquema do mecanismo de inibição mista. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto, ix Ki1 a constante de inibição do complexo enzima substrato e Ki2 a constante de inibição da enzima. ..................................................................................................... 9 FIGURA 1.8-Mecanismo de inibição da enzima Tyr pelo ácido benzoico. Adaptado de CONRAD, et al. 37 . ............................................................................................... 12 FIGURA 1.9-Estrutura das partículas primárias do CB. ......................................... 15 FIGURA 1.10-Estrutura e morfologia do CB. ......................................................... 16 FIGURA 1.11-Possíveis grupos funcionais no CB. ................................................. 18 FIGURA 1.12- Estrutura do DHP. ........................................................................... 21 FIGURA 3.1- Esquema da fabricação do biossensor de Tyr e CB funcionalizado. 27 FIGURA 4. 1- Imagens de MEV obtidas para as amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L −1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB– HNO3/H2SO4 3:1. ..................................................................................................... 29 FIGURA 4. 2-Imagens de MEV obtidas para as amostras: (a) CB e (b) CB–H2O2. .................................................................................................................................. 30 FIGURA 4.3-Espectro Raman do CB não funcionalizado. ..................................... 31 FIGURA 4.4- Espectros Raman na faixa de 1100-1700 cm −1 das amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L −1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB–HNO3/H2SO4 3:1. ......................................................................................... 32 FIGURA 4.5-Ângulo de contato das amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L 1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB–HNO3/H2SO4 3:1 . .................................................................................................................................. 33 x FIGURA 4.6- Dispersões das amostras (a) CB e (b) CB–HNO3/H2SO4 3:1 em hexano. ..................................................................................................................... 35 FIGURA 4.7-Dispersões em (A) água e (B) DMF das amostras: (a) CB, (b) CB– HNO3 2 mol L 1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB– HNO3/H2SO4 3:1....................................................................................................... 35 FIGURA 4.9. Estudo da velocidade de varredura de potenciais empregando-se os eletrodos (A) CB–DHP/GCE e (B) CB–HNO3–H2SO4 1:1–DHP/GCE, obtidos em solução de K3Fe(CN)6 1,0 × 10 −3 mol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 , v = 10 - 500 mV s −1 . Gráficos inseridos (a) log Ipc vs. log v e (b) Ip vs. v 1/2 . ............................................ 39 FIGURA 4.10- Voltamogramas cíclicos obtidos utilizando-se os eletrodos: ( ) GCE, ( ) CB–DHP/GCE, ( ) CB–HNO3 2 mol L 1 , ( ) CB–HNO3, ( ) CB– H2O2–DHP/GCE, ( ) CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE e ( ) CB–HNO3/H2SO4 3:1–DHP/GCE em solução 1,0 × 10−4 mol L−1 de (a) paracetamol, (b) dopamina, (c) hidroquinona e (d) catecol em tampão fosfato 0,1 mol L −1 , pH 7,0, v = 100 mV s −1 . .................................................................................................................................. 42 FIGURA 4.11- (a) Voltamogramas cíclicos obtidos utilizando-se GCE, CB– DHP/GCE e CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE em solução de dopamina 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato 0,1 mol L −1 ; pH 7,0; v = 100 mV s −1 . (b) Curvas de calibração após diferentes concentrações de dopamina. .......................................... 44 FIGURA 4.12-Voltamogramas cíclicos dos eletrodos contendo tirosinase (biossensores) em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L 1 , tampão fosfato pH 7,5; v= 100 mV s −1 . ......................................................................................................... 46 xi FIGURA 4.13-Voltamogramas cíclicos obtidos em diferentes velocidades de varredura de potencial (10–200 mV s−1) para o eletrodo Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10−4 mol L−1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1, pH 7,5. Gráfico inserido −Ipc vs. v 1/2 . ......................................................... 47 FIGURA 4.14-Voltamogramas cíclicos obtidos para o Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato 0,1 mol L −1 com pH variando no intervalo 5,5 – 8,0. Gráfico inserido −Ipc vs. pH. .................. 48 FIGURA 4.15-Voltamogramas cíclicos obtidos para o Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato pH 7,5 com concentração variando no intervalo 0,01 – 0,15 mol L−1 . Gráfico inserido −Ipc vs. concentração de tampão fosfato. .............................................................................. 49 FIGURA 4.17-Amperograma obtido para adição de diferentes concentrações de catecol em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. Gráficos inseridos: (a) resposta da corrente em função da concentração de catecol e (b) curva analítica. ......................................... 51 FIGURA 4.18-Gráfico de Lineweaver-Burck obtido para o biossensor Tyr–CB– HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE a partir de medidas de amperometria para diferentes concentrações de catecol em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. ................................................. 55 FIGURA 4.19- Amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de NaBz em solução catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V, velocidade de agitação 450 rpm. Concentrações de NaBz entre 4,9 × 10 −7 e 9,4 × 10 −5 mol L −1 . ............................................................ 59 xii FIGURA 4.20-Estudo do efeito da concentração da enzima. Gráfico inserido: amperogramas obtidos para os biossensores preparados com diferentes concentrações de enzima (30, 60 e 120 unidades) em solução de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2 V e velocidade de agitação 450 rpm. Faixa de concentração de NaBz para 30 unidades de enzima: 5,8 × 10 −6 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 , 60 unidades: 4,9 × 10 −7 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 e 120 unidades: 4,9 × 10 −7 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 . ................................................. 61 FIGURA 4.21-Estudo do efeito da concentração do substrato. Gráfico inserido: amperogramas obtidos para o biossensor Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE preparado com concentração fixa de enzima (60 unidades) em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) contendo catecol em diferentes concentrações (1,0 × 10 −6 ; 5,0 × 10 −6 e 1,0 × 10 −5 moL −1), potencial aplicado −0,2 V e velocidade de agitação 450 rpm. Faixa de concentração de NaBz para concentração de catecol de 1,0 × 10 −6 mol L −1 : 9,5 × 10 −5 – 9,2 × 10−4 mol L−1; 6,0 × 10−6 mol L−1: 4,9 × 10−7 – 9,2 × 10 −4 mol L −1 e 1,0 × 10 −5 mol L −1 : 9,7 × 10 −7 – 9,2 × 10−4 mol L−1. ................ 63 FIGURA 4.22-Gráficos de Lineweaver-Burk obtidos para catecol na ausência e na presença de NaBz em concentração de 5,0 × 10 −5 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 molL −1 (pH 7,5). ....................................................................................................... 66 FIGURA 4.23-Gráfico de Dixon obtidos para benzoato de sódio em soluções de catecol de concentração 5,0 ×10 −6 e 1,0×10 −5 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 molL −1 (pH 7,5). ....................................................................................................... 68 FIGURA 4.24-Amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de NaBz (faixa de concentrações: 4,9 × 10 −7 ─ 9,2 × 10−4 mol L−1). Concentração de xiii catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. .................................. 70 FIGURA 4.25-Relação entre a porcentagem de inibição e a concentração de NaBz. Gráfico inserido: curva analítica. ............................................................................. 71 xiv RESUMO FUNCIONALIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO CARBON BLACK VULCAN XC-72R PARA APLICAÇÕES EM BIOSSENSORES BASEADOS EM INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Neste trabalho funcionalizou-se o carbon black Vulcan XC-72R utilizando-se cinco tratamentos diferentes, empregando como agentes oxidantes: ácido nítrico, ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. A caracterização física das amostras funcionalizadas foi realizada empregando-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia Raman. Analisando-se os resultados obtidos tem-se que os tratamentos ácidos não alteraram significativamente a morfologia do material. Por outro lado, este tratamento proporcionou um aumento do número de defeitos atribuídos à introdução de grupos funcionais oxigenados. Foram modificados eletrodos de carbono vítreo (do inglês, glassy carbon electrode, GCE) com dispersões aquosas dos materiais em dihexadecil hidrogenofosfato (DHP). Para a caracterização eletroquímica dos eletrodos foram realizados estudos de voltametria cíclica empregando-se a sonda hexacianoferrato de potássio (III). Em todos os casos houve aumento da área eletroativa do eletrodo como consequência da funcionalização do material de carbono. Posteriormente, avaliou-se a resposta dos eletrodos frente a diferentes analitos (dopamina, catecol, paracetamol e hidroquinona), o eletrodo modificado em mistura de ácido nítrico e sulfúrico 1:1 (CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE) apresentou maior sinal analítico para os diferentes compostos investigados. Foram construídas curvas de calibração para a determinação de dopamina utilizando o eletrodo GCE, o eletrodo preparado com CB sem funcionalizar (CB–DHP/GCE) e o eletrodo CB–HNO3/H2SO41:1– DHP/GCE. As sensibilidades (coeficientes angulares das curvas analíticas) foram xv 0,334, 3,65 e 6,54 A cm −2 mol L −1 , respectivamente. Estes resultados mostram um aumento significativo da sensibilidade como consequência da funcionalização do CB, sugerindo uma vantagem sobre o uso do material sem modificação para aplicações eletroanalíticas. Em seguida desenvolveu-se um procedimento analítico para a determinação de benzoato de sódio (sal de sódio do ácido benzoico) baseado na inibição enzimática da tirosinase imobilizada na superfície do eletrodo CB– HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE (biossensor). Foram realizados estudos de mecanismo de inibição e otimização das condições de operação. A curva analítica correspondente apresentou uma faixa linear de concentração de 4,90 × 10 −7 a 1,92 × 10 −5 mol L −1 e um limite de detecção de 2,1 × 10 −7 mol L −1 . xvi ABSTRACT FUNCTIONALIZATION AND CHARACTERIZATION OF CARBON BLACK VULCAN XC-72R FOR APPLICATIONS ON INHIBITION BASED ENZYMATIC BIOSENSORS In this work, carbon black Vulcan XC-72R was functionalized using five different treatments, the oxidizing agents employed were: nitric acid, sulfuric acid and hydrogen peroxide. The physical characterization of functionalized samples was carried out using scanning electron microscopy (SEM) and Raman spectroscopy. The results suggested that the treatments did not significantly alter the morphology of the material in most cases and showed an increase in the number of defects attributed to the introduction of oxygenated functional groups. Glassy carbon electrodes (GCE) were modified with aqueous dispersions of materials in dihexadecyl hydrogen phosphate (DHP). For the electrochemical characterization of the electrodes were performed studies of cyclic voltammetry employing the probe potassium hexacyanoferrate (III). For all cases there was an increase in the electroactive area as a result of the functionalization. Subsequently, the response of the electrodes to different analytes (dopamine, catechol, paracetamol and hydroquinone) was evaluated, the electrode modified in a mixture of nitric and sulfuric acid 1:1 (CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE) showed the highest analytical signal for the different compounds tested. Calibration curves were constructed for the determination of dopamine using the GCE electrode, the electrode prepared with unmodified CB (CB–DHP/GCE) and the CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE electrode, the sensitivities of the analytical curves (angular coefficients of the analytical curves) were: 0.334, 3.65 and 6.54 A cm −2 L mol −1 , respectively. These results show a significant increase in sensitivity as a result of the functionalization xvii of CB suggesting an advantage over the use of unmodified material for electroanalytical applications. Then, an analytical procedure for the determination of sodium benzoate (sodium salt of benzoic acid) based on enzyme inhibition was developed, where the tyrosinase enzyme was immobilized at the surface of the CB– HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE electrode (biosensor). Studies of the inhibition mechanism and optimization of operating conditions were performed. The corresponding analytical curves had linear concentration ranges between 4.90 × 10 −7 and 1.92 × 10 −5 mol L −1 and a detection limit of 2.1 × 10 −7 mol L −1 . xviii Sumário 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1 1.1 Aspetos gerais dos biossensores......................................................................... 1 1.2 Biossensores baseados em inibição enzimática ................................................. 4 1.3 Mecanismos de inibição enzimática................................................................... 5 1.3.1 Inibição competitiva ................................................................................... 6 1.3.2 Inibição acompetitiva ................................................................................. 6 1.3.3 Inibição não competitiva ............................................................................ 7 1.3.4 Inibição mista ............................................................................................. 8 1.4 Determinação de ácido benzoico e/ou benzoato baseada em inibição enzimática ................................................................................................................... 9 1.5 Carbon black .................................................................................................... 14 1.6 Estrutura e morfologia do CB .......................................................................... 15 1.7 Grupos funcionais na superfície do CB ........................................................... 16 1.8 Aplicações do CB em eletroanálises ................................................................ 18 1.9 Dihexadecil hidrogenofosfato .......................................................................... 21 2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 22 3 PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................. 23 3.1 Reagentes e soluções ........................................................................................ 23 3.2 Medidas eletroquímicas ................................................................................... 23 3.3 Funcionalização do CB .................................................................................... 23 3.4 Caracterização morfológica do CB .................................................................. 24 xix 3.5 Caracterização espectroscópica do CB ............................................................ 24 3.6 Medidas de ângulo de contato .......................................................................... 24 3.7 Modificação dos eletrodos de carbono vítreo .................................................. 25 3.8 Imobilização da enzima Tyr ............................................................................. 26 3.9 Preparação das amostras .................................................................................. 27 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 28 4.1 Caracterização do CB funcionalizado .............................................................. 28 4.1.1 Caracterização morfológica ..................................................................... 28 4.1.2 Caracterização por espectroscopia Raman ............................................... 30 4.1.3 Estudo de molhabilidade .......................................................................... 33 4.1.4 Estudo de dispersão .................................................................................. 34 4.2 Caracterização eletroquímica ........................................................................... 36 4.3 Aplicações eletroanalíticas dos eletrodos de CB funcionalizados ................... 41 4.4 Estudos da resposta eletroquímica do catecol .................................................. 45 4.4.1 Estudo do efeito da velocidade de varredura de potencial ....................... 46 4.4.2 Efeito do pH e da concentração do eletrólito suporte .............................. 47 4.4.3 Otimização do potencial de trabalho ........................................................ 50 4.5 Determinação amperométrica de catecol ......................................................... 51 4.5.1 Estudo do comportamento cinético do catecol sobre o biossensor de Tyr ..................................................................................................................53 4.5.2 Estudo da estabilidade do biossensor ....................................................... 56 4.5.3 Estudo de interferentes ............................................................................. 57 xx 4.5.4 Aplicação do biossensor proposto na determinação de catecol em amostras de águas naturais e de torneira .............................................................. 57 4.6 Comportamento do biossensor de Tyr frente à adição de benzoato de sódio: determinação por inibição enzimática de benzoato de sódio ................................... 58 4.6.1 Estudo do efeito da concentração de catecol e da enzima na determinação de benzoato de sódio ............................................................................................ 59 4.6.2 Estudo cinético e mecanismos de inibição para a determinação de NaBz ..................................................................................................................65 4.7 Determinação amperométrica de NaBz baseada em inibição enzimática ....... 69 5 CONCLUSÕES ................................................................................................ 74 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 76 1 Introdução 1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspetos gerais dos biossensores Devido à necessidade de desenvolvimento de métodos analíticos que sejam amigáveis ao meio ambiente e, ao mesmo tempo, sensíveis, seletivos, econômicos e rápidos, diferentes abordagens analíticas têm sido investigadas e vem ocupando posição de destaque frente aos procedimentos analíticos convencionais 1 . Particularmente, os biossensores têm adquirido grande destaque neste cenário por combinar a seletividade fornecida pelo uso de um componente biológico com a sensibilidade e a facilidade de operação característica dos biossensores em geral 2 . Os biossensores são sensores que utilizam um material biológico (enzimas, anticorpos, antígenos, organismos, tecidos animal e vegetal, células, organelas, etc.) conectado a um transdutor que converte o sinal biológico em um sinal quantificavel 3 . A importância destes dispositivos consiste em sua excelente seletividade a qual permite a detecção de um analito mesmo em uma matriz complexa 4 . A interação seletiva entre as enzimas e os seus substratos têm sido explorada na construção de biossensores enzimáticos, nos quais o analito reage pela ação catalítica da enzima, podendo gerar um ou vários produtos detectáveis. A detecção destes produtos é possível devido à presença do transdutor de sinais o qual converte a resposta biológica em um sinal analítico quantificável, o qual pode ser um sinal térmico, ótico, piezoelétrico ou eletroquímico 4 . Na FIGURA 1.1 é apresentada uma ilustração dos componentes gerais dos biossensores enzimáticos. 2 Introdução FIGURA 0.1-Componentes gerais dos biossensores enzimáticos. Adapatado de MOHANTY e KOUGIANOS 5 . Nos biossensores com transdutores térmicos a mudança na temperatura promovida pela absorção das espécies é registrada e relacionada com a entalpia molar e a quantidade de reagentes e produtos 6 . Os transdutores óticos utilizam as mudanças nas propriedades da amostra produzidas por fenômenos óticos como absorção ou fluorescência 4 . Os transdutores piezoeléctricos utilizam as propriedades que possuem alguns materiais (como o quartzo) de mudar a frequência de oscilação em função da sua massa depois de experimentar perturbações mecânicas 7 . Finalmente, o transdutor eletroquímico, como seu nome indica, relaciona a concentração do analito com um sinal eletroquímico que pode ser condutométrico, potenciométrico, impedimétrico ou amperométrico/voltamétrico, sendo estes últimos os mais utilizados 7 . O desempenho e as aplicações dos biossensores enzimáticos são fortemente dependentes do tipo de transdutor de sinal, da fonte da enzima e da interação enzima/substrato e analito/transdutor, sendo este último de grande importância na estabilidade do dispositivo. Nesse contexto, diferentes métodos de imobilização das enzimas no transdutor foram desenvolvidos, entre os mais importantes encontram-se: adsorção sobre a superfície do material, aprisionamento 3 Introdução físico, ligações covalentes e aprisionamento cross-linking 8 . Na FIGURA 1.2 são ilustradas as diferentes técnicas de imobilização. FIGURA 0.2-Tipos de imobilização enzimática. Desde a primeira aplicação das enzimas em análises clínicas em 1962, 9 as pesquisas envolvendo biossensores enzimáticos aumentaram notavelmente. Com isso, houve um rápido desenvolvimento de tópicos de pesquisa envolvendo o isolamento e a utilização de diferentes enzimas como componente biológico, o estabelecimento de estratégias para a imobilização das enzimas e a procura por materiais a serem utilizados como sensores eletroquímicos. Neste último tópico, o interesse é encontrar um material que permita a construção de biossensores de alto desempenho analítico por meio da melhoria das propriedades eletroquímicas do transdutor. Este objetivo tem sido alcançado mediante a utilização de diferentes materiais (principalmente de carbono) e distintas modificações químicas e físicas 4 . 4 Introdução 1.2 Biossensores baseados em inibição enzimática A capacidade de alguns analitos de inibir a velocidade das reações catalisadas por várias enzimas têm sido empregadas no desenvolvimento de biossensores baseados na inibição enzimática. O princípio de funcionamento destes dispositivos baseia-se na quantificação do inibidor a partir de medidas da atividade enzimática na ausência e na presença do inibidor enzimático 10 . Na FIGURA 1.3 ilustra-se o principio de funcionamento dos biossensores amperométricos baseados em inibição enzimática. Na ausência do inibidor a enzima catalisa a reação de um substrato gerando um produto, e a reação do produto na superfície do eletrodo produz um sinal de corrente que é proporcional à concentração do substrato. A adição do inibidor ao sistema ocasiona uma diminuição da atividade catalítica da enzima e, consequentemente, uma diminuição no sinal de corrente detectado (sinal analítico), o qual é inversamente proporcional à concentração do inibidor 11 . FIGURA 0.3- Esquema do principio de funcionamento dos biossensores baseados na inibição enzimática. 5 Introdução O primeiro procedimento envolvendo um dispositivo baseado em inibição enzimática foi reportado em 1962 quando GUILBAULT et al. 12 construíram um biossensor contendo a colinesterase para a detecção de agentes inibidores do sistema nervoso. A partir deste trabalho, diferentes protocolos têm sido desenvolvidos para a quantificação de analitos que vão desde metais pesados 13 até compostos orgânicos como pesticidas 14 e ácidos carboxílicos 15 , entre outros. As pesquisas envolvendo biossensores baseados em inibição enzimática intensificaram significativamente na última década, se focando principalmente na determinação de pesticidas utilizando como material biológico a enzima acetilcolinesterase 10 . Todavia, alguns trabalhos mais recentes reportam a aplicação de outras enzimas na construção de biossensores de inibição para a determinação de diferentes compostos 16,17,18 . 1.3 Mecanismos de inibição enzimática As propriedades do biossensor, assim como a suas aplicações dependem da interação enzima-inibidor, a qual pode ser do tipo reversível ou irreversível. A inibição irreversível caracteriza-se pela formação de ligações covalentes entre o inibidor e o sítio ativo da enzima resultando na perda permanente da atividade enzimática 19 . Inúmeros biossensores reportados na literatura foram baseados na inibição irreversível da enzima acetilcolinesterase pelos pesticidas organofosforados 20,21,22 . No caso da inibição reversível, a enzima recupera a atividade inicial após lavagem com soluções tampão ou água 10 . Os mecanismos de inibição reversível se classificam em: inibição competitiva, acompetitiva, não competitiva e mista 4 , os quais são descritos em detalhes a seguir. 6 Introdução 1.3.1 Inibição competitiva Na inibição competitiva o inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima, impedindo assim parcialmente ou integralmente a ocorrência da reação do substrato catalisada pela enzima. Altas concentrações de substrato podem deslocar o inibidor do centro ativo e, em consequência, a velocidade máxima da reação catalisada pela enzima não é afetada por esta inibição, mas a constante de velocidade é aumentada 23 . Na FIGURA 1.4 é esquematizado o mecanismo de inibição competitiva. FIGURA 0.4- Esquema do mecanismo de inibição competitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. 1.3.2 Inibição acompetitiva Os inibidores acompetitivos se ligam somente ao complexo enzima- substrato (em um sitio diferete do sitio ativo da enzima) e não à enzima livre, como esquematizado na FIGURA 1.5. A formação de um complexo cataliticamente inativo causa mudanças na velocidade de reação e na constante de velocidade 23 . 7 Introdução FIGURA 0.5-Esquema do mecanismo de inibição acompetitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. 1.3.3 Inibição não competitiva No mecanismo de inibição não competitiva, o inibidor se liga tanto à enzima livre quanto ao complexo enzima-substrato em um sítio diferente do substrato. A formação do complexo inibidor-substrato diminui a formação dos produtos e a velocidade de reação. Na FIGURA 1.6 é esquematizado o mecanismo de inibição não competitiva. 8 Introdução FIGURA 0.6-Esquema do mecanismo de inibição não competitiva. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto e Ki a constante de inibição. 1.3.4 Inibição mista Na inibição mista o inibidor se liga à enzima e ao complexo enzima- substrato com diferentes afinidades por ambas espécies. Este tipo de inibidores atuam aumentando a constante de velocidade, diminuindo a velocidade da reação 23 . Na FIGURA 1.7 é esquematizado o mecanismo de inibição mista. 9 Introdução FIGURA 0.7-Esquema do mecanismo de inibição mista. Sendo: E a enzima, S o substrato, P o produto da reação enzimática, I o inibidor, Ks a constante de formação do complexo enzima-substrato, Kp a constante de formação do produto, Ki1 a constante de inibição do complexo enzima substrato e Ki2 a constante de inibição da enzima. 1.4 Determinação de ácido benzoico e/ou benzoato baseada em inibição enzimática Os conservantes são reagentes geralmente adicionados em produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos com o objetivo de preservar e estender a sua qualidade. Entre os conservantes mais utilizados encontram-se os ácidos benzoico e sórbico e os seus respectivos sais de sódio e de potássio 24 . Estes atuam inibindo o crescimento de leveduras e mofo e apresentam atividade antibacteriana 25 . A eficiência destes conservantes é limitada pela sua permeabilidade na membrana celular, sendo que as moléculas não dissociadas (protonadas) difundem-se com maior facilidade através da membrana e, portanto, estes são mais ativos em meio ácido 26 . Devido à sua maior solubilidade em meio aquoso (em comparação com a forma ácida), o benzoato de sódio é comumente usado como conservante em 10 Introdução alimentos em conserva e bebidas não alcoólicas como refrigerantes e sucos. Nos Estados Unidos da América, o benzoato de sódio faz parte da lista de sustâncias consideradas seguras (Generally recognized as save, GRAS) 27 , porém, alguns estudos reportam a relação entre o contato cutâneo com benzoato de sódio e ácido benzoico e o surgimento de alergias respiratórias e cutâneas 28 . As concentrações permitidas deste conservante em produtos alimentícios encontram-se reguladas e dependem da legislação de cada país. No Brasil, o limite de concentração máxima recomendada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é de 0,05 g/100 mg ou 0,05 g/100 mL. Diferentes métodos para a quantificação de benzoato de sódio e ácido benzoico têm sido desenvolvidos, entre os quais destacam-se: Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês “High Performance Liquid Chromatography”)29, eletroforese capilar30, espectroscopia ultra violeta24 e cromatografia gasosa 31 , entre outros. As principais desvantagens destes métodos residem no elevado custo, complexidade de operação, grande tempo de análise e em alguns casos a necessidade de extração das amostras em fase orgânica 32 . Recentemente, os métodos eletroquímicos para a determinação de ácido benzoico têm-se tornado uma alternativa promissora por serem rápidos, econômicos, seletivos e eficientes 33 . Estes métodos baseiam-se na inibição da atividade da enzima tirosinase na presença do ácido benzoico 32 . Tirosinase (Tyr) é uma metaloenzima de cobre que catalisa a hidroxilação de monofenóis para o-difenóis e a oxidação de o-difenóis para o- quinonas 34 . O seu sítio ativo encontra-se formado por dois átomos de cobre (cada um deles ligado a três moléculas de histidina), os quais podem existir em três formas diferentes dependentes do estado de oxidação conhecidas como met, deoxy 11 Introdução e oxy-tirosinase 35 . As equações 1 e 2 apresentam as reações de oxidação de fenol e o-quinona catalisadas pela enzima Tyr na presença de oxigênio. OH Tyr O2 OH OH + + 3H+ + H2O fenol catecol Eq. 1 OH OH + 1/2 O2 O O + H2O catecol o-quinona Tyr Eq. 2 A capacidade de diferentes analitos naturais e sintéticos de inibir a atividade da Tyr tem sido extensivamente estudada devido ao papel fundamental desta enzima no processo de melanogênese em mamíferos e no escurecimento de frutas 36 . Entre os principais inibidores da atividade da Tyr encontram-se os polifenois, flavonoides, pesticidas tipo carbamatos e organofosforados, benzaldeídos e derivados de benzoato e ácido benzoico 36 . O mecanismo de inibição deste último grupo envolve a formação reversível de quelatos com os átomos de cobre impedindo a interação da enzima com o substrato fenólico. Na FIGURA 1.8 apresenta-se o mecanismo de inibição da Tyr pelo ácido benzoico 37 . 12 Introdução FIGURA 0.8-Mecanismo de inibição da enzima Tyr pelo ácido benzoico. Adaptado de CONRAD, et al. 37 . Diferentes biossensores para a determinação de ácido benzoico em meio aquoso e orgânico têm sido desenvolvidos. Em 1995, REVIEJO et al. 38 desenvolveram um biossensor amperométrico de Tyr para determinação de ácido benzoico em um sistema de análise por injeção em fluxo e nessas condições foi obtida uma curva analítica de 1,0 a 7,0 µmol L −1 e um limite de detecção de 0,5 µmol L 1 . MORALES et al. 39 produziram um biossensor para a determinação de ácido benzoico em maionese e refrigerantes à base de cola utilizando como Cu2+ Cu 2+ O O OH Cu2+ O O Cu2+ O Cu2+ Cu2+ O O O H O OH Cu2+ O O Cu2+ O 2O O O O 13 Introdução substrato fenol, obtendo-se um limite de detecção de 9,0 × 10 −7 mol L −1 e intervalo linear da curva analítica de 1,0 a 40 µmol L −1 . STREFFER et al. 35 apresentaram um biossensor bienzimático de Tyr e glicose desidrogenasse utilizando como substrato catecol. O biossensor foi empregado para a determinação de ácido kójico e ácido benzoico, obtendo-se limites de detecção de 100 nmol L 1 . Diferentes materiais têm sido avaliados como modificadores de eletrodos amperométricos/voltamétricos para a imobilização de enzimas para determinação de ácido benzoico. Nesse contexto, SHAN et al. 32 construíram um biossensor amperométrico baseado na imobilização de Tyr em nanopartículas de carbonato de cálcio. O efeito do tipo de substrato, a concentração de enzima e a espessura do filme enzimático foi avaliado e os parâmetros experimentais otimizados. Foram realizados estudos do mecanismo de inibição, encontrando-se que o mecanismo envolvido foi do tipo reversível competitivo por parte do ácido benzoico. O intervalo linear e o limite de detecção encontrados com o sensor proposto foram de 5,6 × 10 −7 a 9,2 × 10 −5 e 8,0 × 10 −8 mol L 1 , respectivamente. SÁNCHEZ et al. 40 construíram um biossensor de Tyr adsorvida em um eletrodo de carbono vítreo modificado com fosfato de cálcio. Estudou-se o funcionamento do biossensor em meio aquoso e na presença de diferentes solventes orgânicos, e este foi finalmente aplicado na determinação de ácido benzoico em maionese e refrigerantes. Materiais de carbono 33 e nanopartículas metálicas 15 têm sido empregados na construção de biossensores de Tyr para a determinação de ácido benzoico. No entanto, não há relatos da determinação de benzoato de sódio ou de potássio em amostras explorando a inibição da Tyr. 14 Introdução 1.5 Carbon black Um aspecto importante a ser considerado na construção de biossensores eletroquímicos é a natureza do material do transdutor o qual é encarregado de converter a resposta biológica em um sinal analítico quantificável. Desta forma, o material utilizado como transdutor deve atender a certos requisitos, como: elevada área superficial, excelente condutividade, estabilidade física e química e a capacidade de aumentar a velocidade da transferência eletrônica. Os materiais de carbono têm sido amplamente utilizados para esta finalidade por apresentar muitas dessas propriedades 1 . Exemplos de materiais de carbono bastante explorados utilizados na construção de sensores e biossensores eletroquímicos incluem o grafite 41 , nanotubos de carbono 21 e grafeno 42 , entre outros. Recentemente, há um crescente interesse na utilização do negro de fumo (do inglês Carbon Black, CB) como material de eletrodo para aplicações eletroanalíticas em decorrência das suas boas propriedades eletroquímicas e baixíssimo custo em comparação com os outros materiais de carbono geralmente utilizados. O termo negro de fumo é empregado para definir um grupo de materiais de carbono produzidos a partir da combustão ou decomposição térmica de diferentes derivados do petróleo 43 . As propriedades físicas do CB são dependentes do processo de produção e segundo este, pode-se classificar em três tipos diferentes, o negro de fumo de forno (furnace black) obtido a partir da combustão de óleo na presença de ar, o negro de fumo de canal (channel black) obtido pela combustão direita de combustíveis fósseis e finalmente o negro de fumo térmico (thermal black) produzido pela decomposição térmica do metano 44 . As aplicações do CB mudam dependendo das propriedades do material e, portanto, do processo de produção. Algumas das suas aplicações encontram-se 15 Introdução na produção de papel, têxteis, revestimentos, pigmentos, catalisadores, baterias e, principalmente, como agente de reforço na produção de borracha 45 . 1.6 Estrutura e morfologia do CB A estrutura do CB tem influência direta nas suas propriedades físico- químicas, e por este motivo tem sido amplamente estudada utilizando-se diferentes técnicas como difração de raios X 46 , espectroscopia de força atômica 47 e microscopia eletrônica de transmissão 48 , entre outras. O CB apresenta uma microestrutura formada por camadas hexagonais paralelas, com uma separação maior do que a apresentada no grafite. Grupos de três ou quatro camadas agrupam- se para formar cristalitos, e estes por sua vez se combinam aleatoriamente formando as partículas primárias 49 . Na FIGURA 1.9 ilustra-se a estrutura das partículas primárias do CB. FIGURA 0.9-Estrutura das partículas primárias do CB. As partículas primárias do CB possuem geometria esférica e diâmetros entre 10 e 100 nm aproximadamente 49 . Estas partículas combinam-se formando aglomerados de diferentes tamanhos e formas, os quais são os responsáveis pela estrutura do material. Quando o CB possui agregados de grande tamanho formados por muitas partículas, este é considerado de estrutura grande. Caso contrário, 16 Introdução considera-se o CB de estrutura pequena 43 . Na FIGURA 1.10 ilustra-se o CB de estrutura grande e pequena. Estrutura pequena Estrutura grande Aglomerado Partícula primária FIGURA 0.10-Estrutura e morfologia do CB. O tamanho das partículas primárias assim como a sua aglomeração podem ser controlados no processo de manufatura e tem influência em propriedades do material como área superficial e tamanho de poro. 1.7 Grupos funcionais na superfície do CB O CB encontra-se composto predominantemente por carbono e hidrogênio, porém, na sua composição pode-se encontrar outros elementos como enxofre, nitrogênio, halogênios e principalmente oxigênio. A proporção e a forma química na qual se encontram estes elementos muda de um tipo de CB para outro e depende diretamente do tipo de hidrocarboneto empregado e do processo de manufatura e estocagem. Geralmente o conteúdo de nitrogênio no CB é baixo em comparação com outros elementos, mas este também pode ser introduzido na superfície do material através de tratamentos que envolvem reagentes tais como amônia e 17 Introdução dimetilamina em altas temperaturas, promovendo-se a formação de complexos carbono-nitrogênio. O enxofre pode-se encontrar no CB formando complexos carbono-enxofre e como sulfetos inorgânicos e orgânicos. Por sua vez, os halogêneos são introduzidos através de processos que envolvem absorção tanto física quanto química 50 . O oxigênio é o elemento de maior influência sobre as propriedades físico-químicas do CB, tais como: molhabilidade, dispersibilidade, atividade catalítica, condutividade, entre outras. Estes grupos podem-se encontrar formando ligações com os átomos de carbono na borda das camadas de grafite (edge plane) ou formando sistemas heterocíclicos 50 . Dependendo da natureza dos grupos funcionais, o CB pode exibir comportamento ácido, básico ou neutro em dispersões aquosas. Os grupos funcionais oxigenados podem ser encontrados no CB como resultado do processo de manufatura, mas também podem ser introduzidos a partir de diferentes tratamentos de funcionalização. Os grupos ácidos, são formados pela funcionalização com oxigênio em temperaturas altas ou pela reação com agentes oxidantes, os grupos básicos se formam quando o CB é aquecido em atmosfera inerte e após o resfriamento deixado em contato com oxigênio e, finalmente, os grupos neutros são formados pela adsorção de oxigênio nos sítios insaturados na superfície do CB 50 . Na FIGURA 1. 11 são apresentados alguns dos grupos funcionais oxigenados que podem ser identificados no CB. 18 Introdução O O OH O OH OH O O OH O OH O OO OH FIGURA 0.11-Possíveis grupos funcionais no CB. A química superficial do CB foi extensivamente estudada empregando-se métodos que envolvem principalmente titulações dos grupos funcionais 51 , análises térmicas 52 e diferentes técnicas espectroscópicas 53,54 . As aplicações deste material são diretamente afetadas pela sua química superficial, e diferentes estudos demonstraram o efeito positivo da funcionalização do CB sobre as suas propriedades adsortivas para a remoção de poluentes 54 , o seu desempenho como suporte na síntese de catalisadores metálicos 55,56 e sobre algumas das propriedades dos compósitos CB-polímero 57 , entre outros. 1.8 Aplicações do CB em eletroanálises Embora em torno de 90% da produção de CB seja destinada para a indústria da borracha (principalmente para a manufatura de pneus de automóveis) 45 , diferentes aplicações deste material foram exploradas com o passar do tempo. 19 Introdução Alguns tipos de CB têm propriedades como grande área superficial, resistência à corrosão e alta condutividade elétrica, as quais são muito atraentes do ponto de vista eletroquímico, e por este motivo têm sido exploradas na fabricação de baterias 58 e catalisadores para células a combustível 59 . Recentemente, o CB foi empregado como um material alternativo para aplicações eletroanalíticas, e suas boas propriedades eletroquímicas combinadas com o seu baixo custo (1 kg por 1 euro) 60 têm feito com que o número de trabalhos utilizando CB como material para eletrodos seja cada vez maior. Um dos primeiros trabalhos envolvendo CB como material para a construção de sensores foi realizado por ARDUINI et al. 61 em 2010, através da avaliação do comportamento voltamétrico de diferentes analitos frente a um eletrodo de pasta de CB N220. Os resultados desse trabalho mostraram deslocamentos nos potenciais de pico para valores menos positivos e incrementos nas correntes de pico para alguns dos analitos em comparação com o eletrodo de pasta de grafite. Posteriormente, ARDUINI et al. 60 demonstraram as vantagens da utilização de dispersões de CB como material modificador. Foram modificados eletrodos impressos (do inglês Screen-Printed Eletrode, SPE) com filmes de CB obtendo-se melhoras na resposta eletroquímica de diferentes analitos em comparação com o SPE sem modificação. A partir deste trabalho, o CB tem sido extensivamente empregado como material para a construção de diferentes sensores 62,63 e biossensores 16,22,64,65 . Uma contribuição importante ao estudo das propriedades eletroquímicas do CB foi realizada em 2014 por VICENTINI et al. 66 ao caracterizar física e morfologicamente três tipos de CB (Vulcan XC-72R, BP 4750 e E2000) e comparar o comportamento de diferentes analitos frente a eletrodos 20 Introdução modificados com dispersões poliméricas dos CBs. Os resultados mostraram um melhor desempenho do eletrodo modificado com CB vulcan XC-72R. O vulcan XC-72R é um tipo de furnance black extensivamente utilizado em eletrocatálise como suporte de catalisadores metálicos para células a combustível, possui área superficial específica de 254 m 2 g −1 e baixa resistividade elétrica 67 . Entre as propriedades deste material destaca-se a facilidade de modificar os grupos funcionais na sua superfície sem alterar significativamente as suas propriedades condutoras, e isto tem sido aproveitado por pesquisadores para avaliar o efeito das mudanças nos grupos funcionais sobre as propriedades dos catalisadores 56,68 . O efeito da química superficial do CB sobre as suas propriedades eletroanalíticas ainda foi pouco estudado. Em 1997, FRYSZ e CHUNG 69 estudaram as mudanças nas propriedades eletroquímicas de eletrodos de CB (acetylene black) após diferentes tratamentos de funcionalização térmica e eletroquímica. Os resultados desse trabalho mostraram mudanças das áreas eletrocatalíticas, das capacitâncias dos eletrodos e aumentos nas constantes de transferência heterogênea de elétrons para a sonda eletroquímica hexacianoferrato (II) de potássio como consequência da funcionalização. Estes resultados foram atribuídos às alterações no tamanho de poro e nos grupos funcionais na superfície do CB. ARDUINI et al. 61 estudaram o efeito da funcionalização química (em meio ácido e básico) e eletroquímica do CB N220 sobre o comportamento voltamétrico de diferentes espécies, encontrando-se uma vantagem do uso do CB funcionalizado em meio ácido para a maioria dos analitos. Embora pesquisas anteriores sugerem a possibilidade de melhorar as propriedades eletroquímicas do CB para aplicações em eletroanálises utilizando tratamentos de funcionalização, ainda são necessários estudos para compreender 21 Introdução como as mudanças estruturais e a natureza dos grupos funcionais afetam a transferência eletrônica. 1.9 Dihexadecil hidrogenofosfato O dihexadecil hidrogenofosfato (DHP, do inglês “Dihexadecyl Hydrogen Phosphate”) é um surfactante hidrofóbico amplamente utilizado (junto com outros materiais) na preparação de sensores e biossensores eletroquímicos. Possui uma cabeça polar com carga negativa e duas cadeias hidrofóbicas longas. Trabalhos anteriores mostraram a capacidade do mesmo de formar filmes homogêneos e estáveis a partir da modificação de eletrodos com dispersões aquosas de DHP 70 e materiais de carbono como nanotubos e CB 66 . Na FIGURA 1.12 apresenta-se a estrutura do DHP. FIGURA 0.12- Estrutura do DHP. 22 Objetivos 2 OBJETIVOS O objetivo deste trabalho foi funcionalizar o carbon black Vulcan XC- 72R utilizando diferentes tratamentos oxidantes, avaliar o efeito da funcionalização sobre as propriedades tanto físicas quanto eletroquímicas do material e empregar o CB funcionalizado na construção de um biossensor de tirosinase para a determinação de catecol e de benzoato de sódio baseada em inibição enzimática.. 23 Parte Experimental 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Reagentes e soluções Tyr (CAS: 2197-63-9) extraída de fungo (≥ 1000 unidades mg−1), dihexadecil hidrogenofosfato (CAS:9002-10-2), catecol (99 %) (CAS: 120-80-9) e hidrocloreto de dopamina (98 %) (CAS: 62-31-7) foram adquiridos da Sigma- Aldrich. O carbon black Vulcan XC-72R (CAS:1333-86-4) foi cedido pela Cabot Corporation. Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico e as soluções foram preparadas em água ultrapura obtida num sistema Milli-Q (Millipore ® , Bedfore, MA) com resistividade superior a 18,2 MΩ cm. 3.2 Medidas eletroquímicas As medidas eletroquímicas foram realizadas em uma célula de vidro de 10 mL com tampa de Teflon ® contendo orifícios para os eletrodos. Foi utilizado um sistema de três eletrodos, sendo que os de trabalho foram os eletrodos de carbono vítreo modificados, como referência foi utilizado o eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3,0 mol L −1 ) e como eletrodo auxiliar uma placa de platina. As medidas foram realizadas utilizando-se um potenciostato µAUTOLAB III (Ecochemie) interfaciado a um computador e gerenciado pelo software GPES 4.9. 3.3 Funcionalização do CB O CB foi funcionalizado usando diferentes tratamentos. Para isto, 50 mg de CB e 100 mL de solução de agente oxidante foram misturados em béqueres. As misturas foram agitadas utilizando-se um agitador magnético durante 30 min à temperatura controlada de 25 ± 1 °C, e após este intervalo de tempo os materiais 24 Parte Experimental foram lavados com água ultrapura até a solução atingir pH 7 e, posteriormente, foram secadas em estufa a 120 °C durante 12 horas. Os diferentes agentes oxidantes empregados foram: HNO3/H2SO4 (3:1 v:v), HNO3/H2SO4 (1:1 v:v), HNO3 concentrado, HNO3 2 mol L −1 e H2O2 (30 % m/v). 3.4 Caracterização morfológica do CB A caracterização morfológica do CB foi realizada empregando-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) de alta resolução, utilizando-se um equipamento modelo Supra 35-VP (Carl Zeiss, Alemanha) com feixe de elétrons de 25 keV. Para a preparação das amostras, 8,0 µL de dispersões de 1,0 mg de CB preparadas em 1,0 mL de água foram depositados sobre placas de carbono vítreo e deixado secar durante 2 h antes dos experimentos. 3.5 Caracterização espectroscópica do CB A caracterização espectroscópica do CB foi realizada empregando-se a espectroscopia Raman, utilizando-se um espectrofotômetro Raman Horiba/Join Yvon Labram com lazer de 540 nm. Para a preparação das amostras, 8,0 µL de dispersões de 1 mg de CB preparadas em 1 mL de água foram depositadas sobre placas de silício, e as amostras foram deixadas secar durante 2 h antes dos experimentos. 3.6 Medidas de ângulo de contato As medidas de ângulo de contato com água deionizada foram realizadas utilizando-se um goniômetro HTM Reetz GMBH modelo DSAHT-12 (Kross) com o software DSA 3 Image. Para a preparação das amostras, 8,0 µL de dispersões de 1,0 mg de CB preparadas em 1,0 mL de água foram depositadas 25 Parte Experimental sobre placas de carbono vítreo, e as amostras foram deixadas secar durante 2 h antes dos experimentos. Para as medidas de molhabilidade, foram depositados 3,0 µL de água sobre as superfícies das placas de carbono vítreo contendo os filmes de CB. 3.7 Modificação dos eletrodos de carbono vítreo Para a modificação do eletrodo de carbono vítreo (do inglês, glassy carbon electrode, GCE) foi preparada uma dispersão de 1,0 mg de CB funcionalizado e 1,0 mg de DHP em 1,0 mL de água ultrapura, e a mistura foi dispersada em ultrassom durante 30 minutos. Antes da modificação, o GCE de 3 mm de diâmetro foi polido com alumina e lavado com água ultrapura e álcool isopropílico em um ultrassom durante 2 minutos. Posteriormente, 8,0 µL da dispersão foram depositados sobre a superfície do eletrodo e o solvente foi deixado evaporar durante 2 h. Na TABELA 3.1 é apresentada a nomenclatura empregada para os eletrodos modificados com cada tipo de CB funcionalizado. 26 Parte Experimental TABELA 3.1- Tratamentos das amostras de CB e nomenclatura empregada Tratamento Amostras Eletrodos – CB CB–DHP/GCE HNO3 2 mol L −1 CB–HNO3 2 mol L −1 CB–HNO3 2 mol L −1– DHP/GCE HNO3 concentrado CB–HNO3 CB–HNO3–DHP/GCE H2O2 30% (m/v) CB–H2O2 CB–H2O2–DHP/GCE HNO3/H2SO4 1:1 (v:v) CB–HNO3/H2SO4 1:1 CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE HNO3/H2SO4 3:1 (v:v) CB–HNO3/H2SO4 3:1 CB–HNO3/H2SO4 3:1– DHP/GCE 3.8 Imobilização da enzima Tyr Para a imobilização da enzima Tyr no GCE modificado utilizou-se o método da ligação covalente cruzada (cross linking) com glutaraldeído como reagente reticulante. Foram misturados sobre a superfície do eletrodo modificado com CB e DHP, 3,0 µL de solução estoque de Tyr de concentração 60 U µL −1 em tampão fosfato pH 7,0; 2,0 µL de solução de glutaraldeído 0,25% (v:v) em água e 2,0 µL de solução de albumina de soro bovino (BSA) 0,1% (m:v) em tampão fosfato pH 7,0. O eletrodo foi deixado secar durante 12 h em um dessecador. Na FIGURA 3.1 apresenta-se o esquema da imobilização da enzima Tyr na superfície do GCE modificado com CB. 27 Parte Experimental FIGURA 3.1- Esquema da fabricação do biossensor de Tyr e CB funcionalizado. 3.9 Preparação das amostras Foi realizada a determinação de catecol em amostras de agua natural e de torneira. A amostra de agua natural foi coletada da represa da universidade Federal de São Carlos (UFSCar) e posteriormente filtrada. A amostra de agua de torneira foi utilizada sem qualquer pre-tratamento. Alíquotas de 920 µL de água natural e 920 µL de água de torneira foram fortificadas com catecol, e 100 µL de cada alíquota foram adicionados na célula contendo 10 mL de solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) para obter uma concentração de catecol de 8,0 ×10 −6 mol L −1 . A determinação de benzoato de sódio foi realizada em uma amostra de cebolas em conserva obtida comercialmente. Uma alíquota de 950 µL de agua de conserva foi fortificada com benzoato de sódio e 100 µL foram adicionados na célula contendo 10 mL de solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) e uma concentração de catecol de 5,0 ×10 −6 mol L −1 para obter uma concentração de benzoato de sódio de 5,0 ×10 −6 mol L −1 . 28 Resultados e Discussão 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Caracterização do CB funcionalizado 4.1.1 Caracterização morfológica As propriedades eletroquímicas dos materiais de carbono são fortemente dependentes da sua estrutura. A estrutura do CB é formada por partículas primárias as quais são combinadas formando agregados de vários tamanhos e formas 71 . Com o objetivo de estudar as possíveis mudanças morfológicas provocadas pelos diferentes tratamentos, avaliou-se por MEV a morfologia do material antes e depois de cada tratamento realizado. Na FIGURA 4.1 são apresentadas as imagens de MEV obtidas para as amostras de CB submetidas aos diferentes agentes de funcionalização, (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L −1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1, e (f) CB–HNO3/H2SO4 3:1. Como pode ser observado, o CB apresentou a morfologia típica de uma estrutura grande, sem mudanças aparentes na estrutura do material como consequência da funcionalização com ácidos. Resultados similares foram obtidos por LÁZARO et al. 68 , encontrando que os tratamentos de oxidação em meio ácido do carbon black à temperatura ambiente e por curtos períodos de tempo não causaram modificações visíveis na sua morfologia. 29 Resultados e Discussão FIGURA 4. 1- Imagens de MEV obtidas para as amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L −1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB– HNO3/H2SO4 3:1. Magnitude: 100 000. No caso do CB funcionalizado com H2O2 30% (m/v) foram observadas mudanças significativas na morfologia como consequência da funcionalização. Na FIGURA 4.2 são apresentadas as imagens de MEV do CB não funcionalizado e do CB–H2O2 para uma ampliação menor (3 µm). No caso da amostra funcionalizada, é possível observar a aparição de buracos como resultado das mudanças na estrutura dos aglomerados do CB e, esse comportamento pode ser atribuído à formação de grupos funcionais carregados na superfície das nanopartículas de CB, os quais aumentam o grau de dispersão entre os aglomerados 45 . 30 Resultados e Discussão FIGURA 4. 2-Imagens de MEV obtidas para as amostras: (a) CB e (b) CB–H2O2. Magnitude: 40 000. Os resultados da caracterização morfológica permitiram concluir que com exceção da funcionalização com peroxido de hidrogênio, não foram observadas mudanças significativas na morfologia do CB como consequência da funcionalização. 4.1.2 Caracterização por espectroscopia Raman O efeito da funcionalização sobre o grau de desordem estrutural tem sido estudado para diferentes materiais de carbono utilizando-se a espectroscopia Raman 72,73 . Na FIGURA 4.3 apresenta-se o espectro Raman do CB não funcionalizado, e se observa a presença da banda G ao redor de 1625 cm 1 , relacionada com as vibrações das ligações duplas carbono - carbono (sp 2 ), e a banda D ao redor de 1366 cm 1 , relacionada com a presença de desordem e defeitos 74 . 31 Resultados e Discussão 1000 1500 2000 2500 3000 G Deslocamento Raman / cm 1 In te n si d a d e / u .a . D FIGURA 4.3-Espectro Raman do CB não funcionalizado. A relação entre as areas das bandas D e G (AD/AG) é comumente utilizada como uma estimativa do grau de desordem em materiais de carbono e, é esperado um incremento do valor desta relação como consequência do aumento do número de defeitos no material e a diminuição no tamanho dos cristalitos. Na FIGURA 4.4 são apresentados os espectros Raman de todas as amostras na faixa de 1200 a 1700 cm 1 , os valores de AD/AG foram calculados como: 1,84; 2,00; 2,18; 2,19; 2,40 e 2,18 para as amostras CB, CB–HNO3 2 mol L −1 , CB–HNO3 , CB–H2O2, CB–HNO3 / H2SO4 1:1 e CB–HNO3/H2SO4 3:1, respectivamente. 32 Resultados e Discussão 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1200 1300 1400 1500 1600 1700 Deslocamento Raman / cm 1 Deslocamento Raman / cm 1 Deslocamento Raman / cm 1 Deslocamento Raman / cm 1 In te n si d a d e / u .a . In te n si d a d e / u .a . In te n si d a d e / u .a . In te n si d a d e / u .a . Deslocamento Raman / cm 1 Deslocamento Raman / cm 1 In te n si d a d e / u .a . In te n si d a d e / u .a . (a) (b) (c) (d) (e) (f) FIGURA 4.4- Espectros Raman na faixa de 1100-1700 cm −1 das amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L −1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB–HNO3/H2SO4 3:1. Como era de se esperar, o valor da relação AD/AG foi maior para todas as amostras de CB funcionalizado em comparação com o CB sem funcionalização, e este resultado pode ser atribuído ao incremento do número de defeitos no material 33 Resultados e Discussão devido à introdução de grupos funcionais oxigenados na borda das camadas de grafeno. Resultados similares têm sido observados para materiais de carbono como nanofibras, nanotubos e grafite 72 . 4.1.3 Estudo de molhabilidade O efeito da funcionalização do CB sobre a sua hidrofilicidade foi estudado a partir de medidas de ângulo de contato com água. Na FIGURA 4.5 são apresentadas as imagens obtidas para as diferentes amostras e os respetivos valores dos ângulos (a média entre os ângulos dos dois extremos). A FIGURA 4.5 (a) corresponde à amostra de CB não funcionalizada, e o valor obtido (40,1°) é menor em comparação com os valores encontrados na literatura para outros materiais de carbono sem pré-tratamento 75 . Esse comportamento pode ser devido a introdução de grupos oxigenados durante o processo de fabricação do CB Vulcan na presença de oxigênio (furnace black). FIGURA 4.5-Ângulo de contato das amostras: (a) CB, (b) CB–HNO3 2 mol L 1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB–HNO3/H2SO4 3:1 . Foi observado a diminuição nos ângulos de contato das amostras de CB funcionalizado em comparação com o CB não funcionalizado, o que pode ser 34 Resultados e Discussão atribuido ao aumento na hidrofilicidade pela introdução de grupos funcionais polares durante os tratamentos de funcionalização. O caráter hidrofílico das amostras de CB obedeceu a seguinte ordem: CB–HNO3/H2SO4 1:1 ˃ CB–HNO3 ˃ CB–HNO3/H2SO4 3:1 ˃ CB–H2O2 ˃ CB–HNO3 2 mol L 1 ˃ CB. 4.1.4 Estudo de dispersão A dispersabilidade do material é uma das propriedades mais importantes a ser levada em consideração na preparação de filmes para modificação de eletrodos. Os grupos funcionais presentes no CB exercem uma grande influência sobre a dispersabilidade deste material e, assim, alguns trabalhos já foram reportados na literatura onde foi avaliado o efeito dos grupos funcionais sobre a dispersibilidade do CB em diferentes meios, principalmente poliméricos 76,77 . O efeito da funcionalização sobre a dispersabilidade do CB foi estudado em três solventes diferentes: água, dimetilformamida (DMF) e hexano. São apresentadas na FIGURA 4.6 as imagens das dispersões de CB e CB– HNO3/H2SO4 3:1 v/v em hexano. Como esperado, observou-se uma diminuição significativa no grau de dispersabilidade como consequência da funcionalização, uma vez que a introdução de grupos funcionais polares sobre a superfície do material diminui a interação desta com um solvente de menor polaridade como o hexano. 35 Resultados e Discussão FIGURA 4.6- Dispersões das amostras (a) CB e (b) CB–HNO3/H2SO4 3:1 em hexano. Na FIGURA 4.7 são apresentadas as imagens das dispersões das diferentes amostras de CB em água e DMF. Não foram observados efeitos negativos da funcionalização sobre a dispersabilidade nos dois solventes que têm sido mais utilizados na preparação de dispersões de CB para modificação de eletrodos 66,62 . FIGURA 4.7-Dispersões em (A) água e (B) DMF das amostras: (a) CB, (b) CB– HNO3 2 mol L 1 , (c) CB–HNO3, (d) CB–H2O2, (e) CB–HNO3/H2SO4 1:1 e (f) CB– HNO3/H2SO4 3:1. (B) (A) (a) (b) (c) (d) (e) (f) (a) (b) (c) (d) (e) (f) (a) (b) 36 Resultados e Discussão 4.2 Caracterização eletroquímica A caracterização eletroquímica dos eletrodos foi realizada por voltametria cíclica com a sonda eletroquímica Fe(CN)6 4−/3− . Na FIGURA 4.8 são apresentados os voltamogramas cíclicos obtidos para o GCE, o GCE modificado com dispersão de DHP (DHP/GCE) e os eletrodos modificados com as diferentes dispersões de CB, em solução de K3Fe(CN)6 1,0 × 10 −3 mol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 para uma velocidade de varredura de 100 mV s −1 . Todos os voltamogramas apresentam um par de picos bem definidos, e são observadas diferenças tanto nas intensidades de corrente quanto nas separações dos potenciais de pico anódico e catódico. A maior intensidade de corrente foi obtida para o eletrodo preparado empregando CB modificado com a mistura de ácidos nítrico e sulfúrico 1:1 ( v/v) (CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE), seguido por CB–H2O2–DHP/GCE, CB– HNO3/H2SO4 3:1–DHP/GCE, CB–HNO3–DHP/GCE, CB–DHP/GCE e, finalmente, CB–HNO3 2 mol L 1 . Observou-se um incremento nas correntes de pico como consequência da funcionalização do CB, com exceção do eletrodo CB–HNO3 2 mol L 1 , que acarretou uma diminuição das correntes de pico. 37 Resultados e Discussão -900 -600 -300 0 300 600 -20 -10 0 10 20 30 I /  A E vs. Ag/AgCl /mV GCE DHP/GCE CB-DHP/GCE CB-HNO3 2 mol L -1 -DHP/GCE CB-HNO3-DHP/GCE CB-H2O2/GCE CB-HNO3/H2SO4 1:1/GCE CB-HNO3/H2SO4 3:1/GCE FIGURA 4.8-Voltamogramas cíclicos dos diferentes eletrodos modificados com CB, obtidos para a solução de K3Fe(CN)6 1,0 × 10 −3 mol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 , v = 100 mV s −1 . Os potenciais de pico anódico e catódico e os valores de ∆Ep (separação entre os potenciais de pico anódico e catódico) obtidos a partir dos voltamogramas cíclicos da FIGURA 4.8 são apresentados na TABELA 4.1. Para o eletrodo DHP/GCE foi observado um aumento no valor de ∆Ep em comparação com o GCE, o que sugere que o DHP bloqueia a superfície do eletrodo diminuindo a velocidade de transferência de elétrons. Para todos os eletrodos modificados com CB foi observada a diminuição no valor de ∆Ep em comparação com o GCE, sugerindo o incremento na velocidade de transferência de elétrons 78 com a introdução do CB. Além disso, obtiveram-se valores menores de ∆Ep para todos os eletrodos de CB funcionalizados em comparação com o eletrodo preparado com CB sem tratamento, 38 Resultados e Discussão mostrando-se a melhora na transferência de elétrons entre o hexacianoferrato (III) de potássio e os eletrodos como consequência da funcionalização do CB. TABELA 4.1- Comparação dos resultados da voltametria cíclica obtidos para diferentes eletrodos para uma solução de K3Fe(CN)6 1,0 mmol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 , v = 100 mV s −1 Eletrodo Epa (mV) Epc (mV) ∆Ep (mV) Ipa (µA) GCE 318,8 103,1 215,7 8,519 DHP/GCE 419,2 32,86 386,3 8,526 CB–DHP/GCE 278,8 147,6 131,1 10,26 CB–HNO3 2 mol L −1– DHP/GCE 258,9 184,9 101,0 7,205 CB–HNO3–DHP/GCE 267,2 180,7 96,50 13,32 CB–H2O2 –DHP/GCE 255,0 196,0 59,00 17,04 CB–HNO3 /H2SO4 1:1– DHP/GCE 265,3 180,0 85,30 23,81 CB–HNO3/H2SO4 3:1– DHP/GCE 255,0 184,0 71,00 15,95 Estudos de voltametria cíclica em diferentes velocidades de varredura foram desenvolvidos para avaliar o comportamento das correntes de pico em função da velocidade de varredura. Na FIGURA 4.9 apresentam-se os voltamogramas registrados para os eletrodos (a) CB–DHP/GCE e (b) CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE em solução K3Fe(CN)6 1,0 × 10 −3 mol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 . Os gráficos inseridos correspondem ao comportamento das correntes de pico 39 Resultados e Discussão em função da raiz quadrada da velocidade de varredura de potencial (v 1/2 ) e o log -Ipc vs. log v . -800 -400 0 400 800 1 200 -40 -20 0 20 40 0 5 10 15 20 25 -20 -10 0 10 20 I  A I pa I pc v 1/2 vs. Ag/AgCl /(mVs -1 ) 1/2 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 0,6 0,8 1,0 1,2 0,44 lo g - I p c/  A log v / mVs -1 (b) E vs. Ag/AgCl /mV I/  A 10 500 (A)(a) -800 -400 0 400 800 1 200 -120 -80 -40 0 40 80 120 5 10 15 20 25 -60 -30 0 30 60 I pa I pc I  A v 1/2 vs. Ag/AgCl / (mVs -1 ) 1/2 1,0 1,5 2,0 2,5 0,8 1,2 1,6 0,48 lo g - I p c   A log v / mVs -1 - (b) I  A E vs. Ag/AgCl / mV 10 500 (B)(a) FIGURA 4.9. Estudo da velocidade de varredura de potenciais empregando-se os eletrodos (A) CB–DHP/GCE e (B) CB–HNO3–H2SO4 1:1–DHP/GCE, obtidos em solução de K3Fe(CN)6 1,0 × 10 −3 mol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 , v = 10 - 500 mV s −1 . Gráficos inseridos (a) log Ipc vs. log v e (b) Ip vs. v 1/2 . 40 Resultados e Discussão Para todos os eletrodos foram observadas relações lineares entre Ip e v 1/2 e todos os coeficientes angulares das retas de linearização dos gráficos log Ipc vs. log v estiveram próximos ao valor teórico de 0,5 para os processos controlados por difusão. Conhecendo-se o controle difusional, foram estimadas as áreas eletroativas dos eletrodos, empregando-se a equação de Randles-Sevcik para sistemas controlados por difusão (Equação 3). IP = ± (2,69 × 10 5 ) n 3/2 A D 1/2 C v 1/2 Eq.3 Sendo Ip a corrente de pico anódico ou catódico, n o número de elétrons envolvidos no processo, A (cm 2 ) área eletroativa do eletrodo, D (cm 2 s −1 ) o coeficiente de difusão da espécie, C (mol cm −3 ) a concentração do analito e v (V s −1 ) a velocidade de varredura. Considerando n = 1, D = 7,6 × 10 −6 cm 2 s −1 e C = 1,0 × 10 −3 mol L −1 . Na TABELA 4.2 apresentam-se os valores dos coeficientes angulares dos gráficos de Ipc vs. v 1/2 e os valores estimados das áreas eletroativas. Na maioria dos casos foram obtidos aumentos na área eletroativa como consequência da funcionalização do CB. O eletrodo CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE apresentou a maior área eletroativa (0,0926 cm 2 ), cerca de três vezes maior do que a obtida para o CB–DHP/GCE. Os resultados sugerem uma vantagem do uso do eletrodo CB modificado com ácido nítrico e sulfúrico na razão 1:1 v/v sobre os outros eletrodos em termos de sinal analítico. 41 Resultados e Discussão TABELA 4.2- Resultados do estudo de velocidade de varredura de potenciais dos diferentes eletrodos em solução de K3Fe(CN)6 1 mmol L −1 em KCl 0,1 mol L −1 e valores de área eletroativa (média das áreas eletroativas obtidas pelas curva de corrente de pico anódica e catódica) Eletrodo Coeficiente angular (A/(Vs 1 ) 1/2 ) Área eletroativa (cm 2 ) GCE 2,37×10 −5 0,0289 CB–DHP/GCE 2,68×10−5 0,0322 CB–HNO3 2 mol L −1 –DHP/GCE 2,04×10−5 0,0288 CB–HNO3–DHP/GCE 3,42×10 −5 0,0478 CB–H2O2–DHP/GCE 6,28×10 −5 0,0837 CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE 6,51×10 −5 0,0926 CB–HNO3/H2SO4 3:1–DHP/GCE 4,78×10 −5 0,0667 A partir dos resultados da caracterização eletroquímica pode ser observado que há um grande efeito da funcionalização do CB sobre as propriedades eletroquímicas frente à sonda Fe(CN)6 4−/3− , a qual é consideravelmente sensível aos defeitos e grupos funcionais na superfície dos eletrodos 74 . Resultados similares foram observados por FRYSZ e CHUNG 69 em 1997 e por ARDUINI et al. 61 em 2010 para os CB acetylene black e N220, respectivamente, e foram atribuídos à introdução de grupos oxigenados na superfície do CB. 4.3 Aplicações eletroanalíticas dos eletrodos de CB funcionalizados A resposta dos diferentes eletrodos frente a quatro analitos de interesse (paracetamol, dopamina, hidroquinona e catecol) foi avaliada por voltametria cíclica em solução de tampão fosfato 0,1 mol L −1 (pH 7,0). Na FIGURA 4.10 estão 42 Resultados e Discussão apresentados os voltamogramas cíclicos obtidos para (a) paracetamol, (b) dopamina, (c) hidroquinona e (d) catecol. FIGURA 4.10- Voltamogramas cíclicos obtidos utilizando-se os eletrodos: ( ) GCE, ( ) CB–DHP/GCE, ( ) CB–HNO3 2 mol L 1 , ( ) CB–HNO3, ( ) CB– H2O2–DHP/GCE, ( ) CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE e ( ) CB–HNO3/H2SO4 3:1–DHP/GCE em solução 1,0 × 10−4 mol L−1 de (a) paracetamol, (b) dopamina, (c) hidroquinona e (d) catecol em tampão fosfato 0,1 mol L −1 , pH 7,0, v = 100 mV s −1 . -200 0 200 400 600 800 1 000 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 0 200 400 600 800 -20 0 20 -400 -200 0 200 400 600 -20 0 20 40 0 200 400 600 800 -60 -40 -20 0 20 40 60 E vs. Ag/AgCl / mV E vs. Ag/AgCl / mV E vs. Ag/AgCl / mV I / A I / A I / A E vs. Ag/AgCl / mV I / A (b)(a) (c) (d) 43 Resultados e Discussão Foram observadas melhoras na resposta voltamétrica dos analitos (em termos de separação dos potenciais de pico e sinal de corrente) como consequência da funcionalização do CB na maioria dos casos. Se observou um efeito da natureza do analito no comportamento nos diferentes eletrodos. As respostas obtidas para catecol e hidroquinona foram semelhantes entre si e diferentes do comportamento observado para paracetamol e dopamina. Isto pode ser atribuido à existência de interações entre as moléculas avaliadas e os grupos funcionais, os quais podem mudar dependendo do tratamento de funcionalização. Como era esperado, o maior sinal analítico em todos os casos foi obtido empregando-se o CB–HNO3/H2SO4 1:1 v/v–DHP/GCE e assim esse eletrodo foi selecionado para estudos posteriores. Os resultados obtidos podem ser atribuídos à maior hidrofilicidade e maior área eletroativa observadas para este eletrodo. A resposta dos eletrodos GCE, CB–DHP e CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE frente à adição de diferentes concentrações de dopamina em tampão fosfato 0,1 mol L -1 (pH 7,0) foi avaliada empregando-se voltametria cíclica. Na FIGURA 4.11 apresentam-se a resposta voltamétrica dos três eletrodos em solução de dopamina 1,0 × 10 −4 mol L −1 e as curvas analíticas correspondentes. As sensibilidades das curvas analíticas (método voltamétrico) foram 0,334; 3,65; e 6,54 A cm −2 mol −1 L para os eletrodos GCE, CB–DHP e CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE, respectivamente. Esses resultados mostram um aumento significativo na sensibilidade como consequência da funcionalização do CB (1,8 vezes maior), sugerindo uma vantagem sobre o uso do material sem modificação para aplicações eletroanalítica. Sendo assim, o CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE foi selecionado como eletrodo para o desenvolvimento do biossensor. 44 Resultados e Discussão 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -30 -15 0 15 30 45 Evs. Ag/AgCl/ mV I  A CB - HNO 3 / H 2 SO 4 1:1 DHP/ GCE CB - DHP / GCE GCE (a) 20 40 60 80 0 20 40 60 80 [Dopamina] / 10 -7 / mol L -1 j/ m A c m -2 CB - HNO 3 / H 2 SO 4 1:1 DHP / GCE CB - DHP / GCE GCE (b) FIGURA 4.11- (a) Voltamogramas cíclicos obtidos utilizando-se GCE, CB– DHP/GCE e CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE em solução de dopamina 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato 0,1 mol L −1 ; pH 7,0; v = 100 mV s −1 . (b) Curvas de calibração após diferentes concentrações de dopamina. 45 Resultados e Discussão 4.4 Estudos da resposta eletroquímica do catecol A enzima Tyr foi imobilizada sobre a superfície do eletrodo CB– HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE utilizando-se o método das ligações covalentes cruzadas com glutaraldeído e BSA. O glutaraldeído foi empregado para promover ligações covalentes entre os grupos amino da Tyr e a BSA. Na FIGURA 4.12 são apresentados os voltamogramas cíclicos do biossensor Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE e do biossensor construído com CB não funcionalizado (Tyr–CB– DHP/GCE) obtidos em solução de catecol 1,0 × 10− 4 mol L− 1 em solução de tampão fosfato 0,075 mol L− 1 , pH 7,5. A enzima imobilizada na superfície do eletrodo catalisa a oxidação de catecol para o-quinona. A o-quinona produzida na reação enzimática é reduzida eletroquimicamente a catecol na superfície do eletrodo 79 aumentando o sinal de corrente de redução para ambos os casos. Pode-se observar que o melhor desempenho em termos de intensidade do sinal de corrente de redução foi obtido para o biossensor construído com CB funcionalizado. A corrente de pico catódica aumentou de −10,5 μA no Tyr–CB–DHP/GCE para −15,6 μA no caso do Tyr–CB– HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE. Este comportamento pode ser atribuído à maior área superficial e maior hidrofilicidade do CB funcionalizado. 46 Resultados e Discussão -400 -200 0 200 400 600 -16 -12 -8 -4 0 4 I /  A E vs. Ag/AgCl / mV Tyr-CB-DHP/GCE Tyr-CB-HNO 3 /H 2 SO 4 1:1/GCE FIGURA 4.12-Voltamogramas cíclicos dos eletrodos contendo tirosinase (biossensores) em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L 1 , tampão fosfato pH 7,5; v= 100 mV s −1 . 4.4.1 Estudo do efeito da velocidade de varredura de potencial O efeito da velocidade de varredura de potencial na resposta eletroquímica do catecol para o biossensor Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE foi avaliado em tampão fosfato 0,075 mol L− 1 . Na FIGURA 4.13, são apresentados os voltamogramas cíclicos obtidos em diferentes velocidades de varredura (10 até 200 mV s− 1 ), a partir dos quais é possível se verificar o aumento das correntes de pico anódico e catódico e da separação dos potenciais de pico com o aumento da velocidade de varredura. As correntes de pico apresentaram uma dependência linear com a raiz quadrada da velocidade de varredura de potencial (v 1/2 ) indicando 47 Resultados e Discussão que o processo redox foi controlado pela difusão do catecol até a superfície do eletrodo. Trabalhos anteriores reportaram uma resposta similar do catecol frente à biossensores de Tyr 80 . -400 -200 0 200 400 600 -14 -7 0 4 8 12 16 4 8 12 v 1/2 vs. Ag/AgCl (mVs -1 ) 1/2 -I p c ( A )I /  A E vs. Ag/AgCl / mV 10 200 FIGURA 4.13-Voltamogramas cíclicos obtidos em diferentes velocidades de varredura de potencial (10–200 mV s−1) para o eletrodo Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10−4 mol L−1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 , pH 7,5. Gráfico inserido −Ipc vs. v 1/2 . 4.4.2 Efeito do pH e da concentração do eletrólito suporte A atividade catalítica das enzimas é fortemente dependente do pH do meio e, portanto, a influência do pH na redução de catecol utilizando-se biossensor proposto foi avaliada para valores de pH entre 5,5 e 8,0. Para este estudo foi 48 Resultados e Discussão empregada a voltametria cíclica e solução de catecol 1,0 × 10− 4 mol L− 1 em tampão fosfato 0,1 mol L− 1 . Os voltamogramas cíclicos registrados são apresentados na FIGURA 4.14. A faixa de pH estudada foi escolhida considerando-se trabalhos prévios na literatura sobre a atividade da enzima tirosinase 81 . No gráfico inserido da FIGURA 4.14 apresenta-se o comportamento da corrente de pico catódico em função do pH, e observou-se que a corrente atingiu seu valor máximo em pH = 7,5 e, portanto, este pH foi selecionado para os estudos posteriores. FIGURA 4.14-Voltamogramas cíclicos obtidos para o Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato 0,1 mol L −1 com pH variando no intervalo 5,5 – 8,0. Gráfico inserido −Ipc vs. pH. A influência da concentração do tampão fosfato na redução de catecol foi avaliada no intervalo entre 0,010 e 0,15 mol L− 1 . Na FIGURA 4.15 observa-se o -400 0 400 800 -20 -15 -10 -5 0 5 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 10 11 12 13 pH -I p c   A E vs. Ag/AgCl/ mV I/  A 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 49 Resultados e Discussão aumento da corrente com o aumento da concentração de tampão fosfato até 0,075 mol L −1 , e após essa concentração foi observado uma diminuição do sinal analítico. Este resultado tem sido observado para biossensores de tirosinase e é atribuído à inibição da enzima na presença de concentrações altas de fosfato 14 . Portanto, a solução de tampão fosfato pH 7,5; 0,075 mol L −1 foi selecionada como eletrólito suporte para estudos posteriores. FIGURA 4.15-Voltamogramas cíclicos obtidos para o Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato pH 7,5 com concentração variando no intervalo 0,01 – 0,15 mol L−1 . Gráfico inserido −Ipc vs. concentração de tampão fosfato. -400 0 400 800 -20 -10 0 10 0.05 0.10 0.15 0.20 12.0 12.6 13.2 -I p c ( A ) [Tampão fosfato] (mol L -1 ) 50 100 150 200 12,0 12,4 12,8 13,2 -I (  A ) [Tampão fosfato] mmol L -1 -I (  A ) I   A E vs. Ag/AgCl/ mV 0,010 mol L -1 0,050 mol L -1 0,075 mol L -1 0,10 mol L -1 0,15 mol L -1 50 Resultados e Discussão 4.4.3 Otimização do potencial de trabalho O efeito do potencial de trabalho empregado nas medidas amperométricas sobre a intensidade do sinal de corrente foi estudado na faixa de −0,30 V a +0,10 V em solução de catecol 1,0 × 10−4 mol L−1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) e velocidade de agitação de 450 rpm. Na FIGURA 4.16 é apresentado o comportamento da corrente catódica em função do potencial de trabalho aplicado. Observou-se o aumento da corrente a partir de potenciais mais negativos até −0,20 V, e a partir deste valor de potencial houve uma diminuição na corrente. Considerando estes resultados, para a construção da curva analítica o potencial de trabalho selecionado foi igual a −0,20 V. -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 I/  A E vs. Ag/AgCl / V FIGURA 4.16-Influência do potencial de trabalho sobre a redução de catecol. Estudos realizados em solução de catecol 1,0 × 10 −4 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5). Velocidade de agitação de 450 rpm. 51 Resultados e Discussão 4.5 Determinação amperométrica de catecol Uma vez encontradas as melhores condições experimentais, foi construída uma curva analítica para a determinação de catecol empregando-se amperometria. Na FIGURA 4.17 é apresentado o amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de catecol, e os gráficos inseridos correspondem a magnitude de corrente em função da concentração de catecol e à respectiva curva analítica. A equação que representa a curva analítica é: ∆Ip (µA) = −0,21 + 5,39 × 10 5 [catecol] (mol L −1 ). O limite de detecção (calculado como sendo três vezes o desvio padrão do branco (n = 10) dividido pela sensibilidade, ou seja, o coeficiente angular da curva analítica) foi calculado como 8,7 × 10 −8 mol L− 1 . FIGURA 4.17-Amperograma obtido para adição de diferentes concentrações de catecol em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. Gráficos inseridos: (a) resposta da corrente em função da concentração de catecol e (b) curva analítica. 400 800 1200 1600 -15 -10 -5 0 5 0 5 10 15 20 0 2 4 6 8 10 12 [Catecol]/1x10 7 / molL 1  I/  A 0 10 20 30 40 0 5 10 15 [Catecol]/1x10 7 /mol L 1  I  A Statistics On Rows of [Book1]Sheet1!Col(C):Col(D) % (4,@LG) (b) I / A t / s (a) 52 Resultados e Discussão Na TABELA 4.3 é apresentada uma comparação entre os parâmetros analíticos obtidos para o biossensor de Tyr e CB funcionalizado e os encontrados na literatura para diversos biossensores contendo a Tyr na determinação de catecol. Se observa que o biossensor Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE apresentou um menor limite de detecção e maior sensibilidade analítica em relação aos obtidos pela maioria dos biossensores reportados 79,81,82,83,84 , nos quais são utilizados materiais mais custosos (como nanotubos de carbono) e arquiteturas mais complexas. 53 Resultados e Discussão TABELA 4.3- Comparação dos parâmetros analíticos para diferentes biossensores de tirosinase Biossensor Intervalo linear (µmol L −1 ) Limite de detecção (µmol L −1 ) Sensibilidade (mA mol −1 L) Referência Nafion–Tyr–ZnO/GCE 10–1000 4,0 2,14 82 Tyr–MWCNT–PPy/GCE 3,0–50 0,67 8,0 83 Tyr–IL–MWCNT–DHP/GCE 4,9–1100 0,58 32,8 81 Tyr/MWCNTs/AuNPs/AEP/Au 1,0 – 500 0,80 150 84 Tyr–Nafion–MWCNT/GCE 1–23 0,22 346 79 Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE 1–20 0,087 539 Este trabalho Tyr–PAMAN–GO–CMC/GCE 0,002–0,4 0,00090 630 85 Tyr–MWCNT–ZnO–Nafion/GCE 0,03–32 0,030 1890 86 MWCNT: nanotubos de carbono de paredes múltiplas; PPy: polipirrol; IL: líquido iônico; AuNPs: nanopartículas de ouro; AEP: Acetona extraída de própolis; Au: eletrodo de ouro; PAMAN: poliamidoamina, GO: óxido de grafeno, CMC: carboximetilcelulose. Estudo do comportamento cinético do catecol sobre o biossensor de Tyr. 54 Resultados e Discussão O comportamento cinético do catecol na superfície do biossensor Tyr– CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE foi estudado a partir dos valores da constante aparente de Michaelis-Menten (KM app ), a qual corresponde à constante de velocidade da dissociação do complexo enzima-substrato e é uma estimativa da afinidade da enzima pelo substrato. O valor de KM app foi estimado utilizando-se a equação de Lineweaver-Burck (Eq. 4). 1 s 1 max app max × 1 [Catecol] Eq. 4 sendo Is a corrente no estado estacionário medida para o produto da reação enzimática e Imax a corrente máxima do sistema obtida para condições de saturação da enzima. Na FIGURA 4.18 é apresentado o gráfico de Lineweaver-Burck para o biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE. A reta obtida segue a equação: 1/Is (µA −1 )= 0,0095 + 1,87 × 10 −6 /[catecol] (mol L −1 ) (coeficiente de correlação 0,999). O valor de KM app obtido a partir destes resultados foi igual a 2,0 × 10 −5 mol L −1 . 55 Resultados e Discussão FIGURA 4.18-Gráfico de Lineweaver-Burck obtido para o biossensor Tyr–CB– HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE a partir de medidas de amperometria para diferentes concentrações de catecol em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. Na TABELA 4.4 apresenta-se os valores de KM app encontrados na literatura para diferentes biossensores de Tyr. Para o biossensor Tyr–CB-HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE foi obtido um valor de KM app menor do que o obtido para a Tyr livre 87 , e para a enzima imobilizada em diferentes superfícies como nanotubos de carbono 81 e nanopartículas de óxido de zinco 82 . Estes resultados indicam uma grande afinidade da enzima imobilizada no eletrodo de CB funcionalizado pelo catecol. 0,0 0,3 0,6 0,9 0 1 2 3 -I - 1 / (  A )- 1 [Catecol] -1 / Lmol -1 56 Resultados e Discussão TABELA 4.4-Valores de KM app para diferentes biossensores de Tyr Biossensor 𝑲 (mol L −1 ) Referência Tyr–PPy/Pt 1,0 × 10 −1 88 Tyr livre 4,0 × 10 −3 87 Nafion–Tyr–ZnO/GCE 1,7 × 10 −3 82 Tyr–IL–MWCNT–DHP/GCE 1,9 × 10 −4 81 Tyr–Nafion–MWCNT/GCE 2,6 × 10 −5 79 Tyr–CB–HNO 3 /H 2 SO 4 1:1– DHP/GCE 2,0 × 10 −5 Este trabalho Tyr–MWCNT–ZnO–Nafion/GCE 2,0 × 10 −5 86 Tyr–PAMAN–GO–CMC/GCE 7,2 × 10 −6 85 4.5.1 Estudo da estabilidade do biossensor Com o objetivo de avaliar a estabilidade do biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE, foram realizados estudos de repetibilidade intra-dia (n = 5) e inter-dias (n = 3) a partir do monitoramento do sinal de corrente para uma concentração de catecol de 5,0 × 10 −6 mol L −1 em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5). Foram obtidos valores da porcentagem de desvio padrão relativo (% RSD) de 3,3% e 3,8% para os estudos intra e inter-dias, respectivamente, o que sugere uma boa estabilidade da resposta do biossensor proposto. Os estudos de repetibilidade inter-dias foram realizados utilizando-se um biossensor novo em cada dia. Os resultados obtidos nesse estudo mostram uma boa reprodutibilidade da preparação do dispositivo. 57 Resultados e Discussão 4.5.2 Estudo de interferentes O efeito de alguns possíveis interferentes na determinação de catecol em amostras de águas naturais foi estudado por amperometria em solução de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) na presença dos possíveis interferentes em potencial na concentração de 5,0 × 10 −5 mol L −1 . Os resultados da comparação das correntes na ausência e na presença dos compostos concomitantes (KCl, MgCl2, Ca3(PO4)2 e Na2CO3) mostraram uma variação inferior à 4,63% indicando a ausência de interferência significativa. 4.5.3 Aplicação do biossensor proposto na determinação de catecol em amostras de águas naturais e de torneira A aplicabilidade do biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE proposto na determinação de catecol em amostras de água foi avaliada a partir de estudos de adição e recuperação do analito. Para isto, alíquotas de 920 µL de água natural e 920 µL de água de torneira foram fortificadas com catecol, e 100 µL de cada alíquota foram adicionados na célula contendo 10 mL de solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) para obter uma concentração de catecol de 8,0 ×10 −6 mol L −1 . Foram obtidos porcentagens de recuperação de 106 % e 94,8% para as amostras de água natural e água de torneira , respectivamente. Desta forma, mostrou-se que não houve interferência significativa das matrizes de cada amostra sobre a determinação de catecol utilizando o biossensor proposto. 58 Resultados e Discussão 4.6 Comportamento do biossensor de Tyr frente à adição de benzoato de sódio: determinação por inibição enzimática de benzoato de sódio A resposta voltamétrica do biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1– DHP/GCE para soluções de benzoato de sódio (NaBz) em concentrações crescentes em uma solução de catecol foi estudada utilizando-se amperometria. Na FIGURA 4.19 apresenta-se o amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de NaBz entre 4,9 × 10 −7 e 9,4 × 10 −5 mol L −1 em solução de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5). A adição da solução de catecol no eletrólito suporte causa um aumento da corrente catódica de redução da o-quinona formada na reação do catecol com oxigênio catalisada pela enzima imobilizada no biossensor. À medida que vai sendo adicionada concentrações crescentes de solução de NaBz, a atividade dessa enzima diminui e, consequentemente, a concentração de o-quinona gerada na reação enzimática diminui, decrescendo assim o sinal analítico, como mostrado na figura. Assim, o NaBz inibi a atividade catalítica da enzima Tyr proporcionalmente a sua concentração, sendo desta forma determinado. 59 Resultados e Discussão FIGURA 4.19- Amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de NaBz em solução catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V, velocidade de agitação 450 rpm. Concentrações de NaBz entre 4,9 × 10 −7 e 9,4 × 10 −5 mol L −1 . 4.6.1 Estudo do efeito da concentração de catecol e da enzima na determinação de benzoato de sódio O efeito da concentração da enzima imobilizada no biossensor Tyr– CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE na determinação de NaBz foi estudado utilizando-se amperometria. Na FIGURA 4.20 apresenta-se as porcentagens de inibição na resposta analítica em função da concentração do inibidor NaBz para os biossensores preparados com diferentes concentrações de enzima (30, 60 e 120 0 200 400 600 800 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 NaBz t/s I/  A Catecol 60 Resultados e Discussão unidades). As curvas foram obtidas para adições de concentração crescente de NaBz em soluções de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5). Os valores da porcentagem de inibição foram calculados a partir dos dados dos amperogramas (FIGURA 4.20 gráfico inserido) utilizando-se a Equação 5. Eq.5 sendo I0 o valor de corrente na ausência do inibidor e Iinib a corrente obtida para a adição de uma concentração conhecida do inibidor 23 . No gráfico inserido da FIGURA 4.20, observa-se um aumento do sinal analítico para a redução de o-quinona a catecol com o aumento da concentração da enzima de 30 para 60 unidades. Porém, para concentrações de enzima muito altas (120 unidades) houve uma diminuição do sinal de corrente, a qual pode ser atribuída à formação de filmes espessos que limitam a difusão da o-quinona produzida na reação enzimática até a superfície do eletrodo 14 . %Inibição 0− inib 0 ×100 61 Resultados e Discussão FIGURA 4.20-Estudo do efeito da concentração da enzima. Gráfico inserido: amperogramas obtidos para os biossensores preparados com diferentes concentrações de enzima (30, 60 e 120 unidades) em solução de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2 V e velocidade de agitação 450 rpm. Faixa de concentração de NaBz para 30 unidades de enzima: 5,8 × 10 −6 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 , 60 unidades: 4,9 × 10 −7 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 e 120 unidades: 4,9 × 10 −7 - 9,2 × 10 −4 mol L −1 . Na TABELA 4.5 são sumarizados alguns parâmetros de desempenho analítico para determinação de NaBz extraídos das curvas apresentadas na FIGURA 4.20, obtidas para os biossensores preparados com diferentes 0 300 600 900 0 30 60 90 0 1000 2000 3000 4000 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 t/s I/  A In ib / % [NaBz]/1x10 -7 / mol L -1 30 Unidades 60 Unidades 120 Unidades 62 Resultados e Discussão concentrações da enzima Tyr. Como pode ser observado, houve um aumento da sensibilidade analítica com o acréscimo da concentração de enzima de 30 para 60 unidades. Todavia, como era de se esperar, para uma concentração de enzima de 120 unidades houve uma diminuição da sensibilidade, atribuída às limitações na difusão tanto da o-quinona até a superfície do eletrodo, quanto do NaBz até o sítio ativo da enzima 32 . Levando-se em consideração estes resultados, selecionou-se para os estudos posteriores uma concentração enzimática de 60 unidades por eletrodo. TABELA 4.5-. Efeito da concentração de enzima Tyr utilizada para preparação do biossensor sobre os parâmetros analíticos para a determinação de NaBz. Resultados extraídos das curvas da FIGURA 4.20 Concentração de enzima (unidades) Intervalo Lineal (mol L −1 ) Inibição máxima (%) Sensibilidade (%L mol −1 ) 30 5,8 × 10 −6 –9,4 × 10−5 84,7 93777 60 4,9 × 10 −7–1,9 × 10−5 78,3 819657 120 4,9 × 10 −7–3,8 × 10−5 66,2 475341 Posteriormente, avaliou-se o efeito da concentração do substrato (catecol) sobre a determinação de NaBz utilizando-se o biossensor Tyr–CB– HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE preparado com concentração fixa de enzima de 60 unidades por eletrodo. Na FIGURA 4.21 são apresentadas as curvas de inibição obtidas para três concentrações diferentes de catecol (1,0 × 10 −6 , 5,0 × 10 −6 e 1,0 × 10 −5 mol L −1 ) em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5). 63 Resultados e Discussão FIGURA 4.21-Estudo do efeito da concentração do substrato. Gráfico inserido: amperogramas obtidos para o biossensor Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE preparado com concentração fixa de enzima (60 unidades) em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) contendo catecol em diferentes concentrações (1,0 × 10 −6 ; 5,0 × 10 −6 e 1,0 × 10 −5 moL −1 ), potencial aplicado −0,2 V e velocidade de agitação 450 rpm. Faixa de concentração de NaBz para concentração de catecol de 1,0 × 10 −6 mol L −1 : 9,5 × 10 −5 – 9,2 × 10−4 mol L−1; 6,0 × 10−6 mol L−1: 4,9 × 10−7 – 9,2 × 10 −4 mol L −1 e 1,0 × 10 −5 mol L −1 : 9,7 × 10 −7 – 9,2 × 10−4 mol L−1. Na TABELA 4.6 são sumarizados alguns parâmetros de desempenho analítico para determinação de NaBz obtidos a partir das curvas apresentadas na FIGURA 4.21. Assim, foi verificado um aumento da sensibilidade como consequência do aumento da concentração de catecol. Além disso, pode-se 0 300 600 900 0 30 60 90 0 1000 2000 3000 4000 -5 -4 -3 -2 -1 0 t/s I  A [NaBz]/1x10 -7 / mol L -1 In ib / % Catecol 1,0 10 -6 mol L -1 Catecol 5,0 10 -6 mol L -1 Catecol 1,0 10 -5 mol L -1 64 Resultados e Discussão observar o efeito da concentração do substrato sobre as concentrações mínimas detectáveis do inibidor (analito). Para a menor concentração de catecol estudada (1,0 × 10 −6 mol L −1 ), a menor concentração de NaBz que ocasionou uma mudança perceptível de corrente foi de 9,5 × 10 −6 mol L −1 , e este valor é alto em comparação com o obtido para a concentração de catecol de 5,0 × 10 −6 mol L −1 . Este efeito pode ser atribuído à baixa corrente de redução da o-quinona obtida para concentrações de catecol baixas (Ver amperogramas apresentados no gráfico inserido da FIGURA 4.21). Para a concentração de catecol maior (1,0 × 10 −5 mol L −1 ), a menor concentração de inibidor detectada também foi alta em comparação com o resultado obtido para a concentração de catecol de 5,0 × 10 −6 mol L −1 . Este resultado sugere que concentrações altas do substrato interferem na interação do inibidor com a enzima. Levando-se em consideração os resultados dos estudos de concentração de enzima e substrato, selecionou-se como condição de trabalho uma concentração enzimática de 60 unidades por eletrodo e concentração de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 . 65 Resultados e Discussão TABELA 4.6- Efeito da concentração de catecol sobre os parâmetros analíticos para a determinação de NaBz. Resultados extraídos das curvas da FIGURA 4.21 [Catecol] (mol L −1 ) Intervalo Lineal (mol L−1 ) Inibição máxima (%) Sensibilidade (% L mol −1 ) 1,0 × 10 −6 9,5× 10 −6 – 9,4 × 10 −5 59,3 192415 5,0 × 10 −6 4,9 × 10 −7 – 1,9 × 10 −5 78,3 819657 1,0 × 10 −5 9,7 × 10 −7 – 9,5 × 10 −6 69,5 843209 4.6.2 Estudo cinético e mecanismos de inibição para a determinação de NaBz É conhecido que a natureza do transdutor de sinal e do tipo de imobilização da enzima pode ter influência sobre o comportamento cinético do inibidor e, consequentemente, sobre o mecanismo de inibição 23 . O mecanismo de inibição do biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE foi avaliado a partir dos gráficos de Lineweaver-Burk na ausência e na presença do inibidor. Na FIGURA 4.22 são apresentados os gráficos de Lineweaver-Burk obtidos em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) para a adição de concentrações crescentes de catecol na ausência do inibidor e na presença de uma concentração de NaBz de 5,0 × 10 −5 mol L −1 . 66 Resultados e Discussão FIGURA 4.22-Gráficos de Lineweaver-Burk obtidos para catecol na ausência e na presença de NaBz em concentração de 5,0 × 10 −5 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 molL −1 (pH 7,5). Os interceptos e inclinações das retas estão relacionados com os valores de Imax e KM app a partir da equação de Lineweaver-Burk (Equação 4). Quanto maior o coeficiente linear da reta obtida maior o valor da constante e, menor a afinidade da enzima pelo substrato. Observa-se que para este caso não houve mudanças significativas nos interceptos das retas (1/Imax), porém, houve um aumento no valor de KM app como consequência da introdução do inibidor no sistema. Este comportamento corresponde ao esperado para mecanismos de inibição reversível competitiva, onde o substrato e o inibidor competem pelo 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 0 10 20 30 × -I -1  ( A )- 1 [Catecol] -1 / L mol -1 NaBz 0 mol L -1 NaBz 5,0 10 -5 mol L -1 67 Resultados e Discussão mesmo sítio ativo da enzima e a presença do inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato 89 . Os gráficos de Dixon são comumente utilizados para identificar o mecanismo de inibição e estimar o valor das constantes de inibição aparentes ( ). Na FIGURA 4.23 apresentam-se os gráficos de Dixon os quais relacionam o comportamento dos recíprocos das correntes em função da concentração do inibidor para duas concentrações diferentes do substrato catecol (5,0 × 10 −5 e 5,0 × 10 −6 mol L −1 ). Novamente, observou-se o comportamento típico de um processo de inibição enzimática competitiva, o qual envolve a diminuição do coeficiente angular da reta como consequência do aumento na concentração do substrato, indicando que para concentrações do substrato infinitas a inclinação tende a zero e não haverá efeito do inibidor 32 . 68 Resultados e Discussão -400 0 400 800 0,4 0,8 1,2 × [NaBz]/1x10 -6 / mol L -1 -I - 1  ( A )- 1 Catecol 1,0 10 -5 mol L -1 Catecol 5,0 10 -6 mol L -1 × FIGURA 4.23-Gráfico de Dixon obtidos para benzoato de sódio em soluções de catecol de concentração 5,0 ×10 −6 e 1,0×10 −5 mol L −1 em tampão fosfato 0,075 molL −1 (pH 7,5). A constante de dissociação do complexo enzima-inibidor (constante de inibição aparente ) pode ser estimada a partir do cruzamento entre os gráficos de Dixon. O valor de obtido neste trabalho foi de 82 µmol L −1 . Na TABELA 4.7 são comparados os valores de encontrados na literatura para diferentes biossensores de Tyr usados na determinação de ácido benzoico com o resultado obtido neste trabalho. Observa-se que o valor de encontrado neste trabalho é maior do que relatado na literatura para a determinação de ácido benzoico, podendo 69 Resultados e Discussão isto ser atribuído à grande afinidade pelo catecol apresentada pela enzima imobilizada no CB funcionalizado 32 . TABELA 4.7- Comparação das constantes de inibição para diferentes biossensores de Tyr utilizados na determinação de ácido benzoico Biossensor 𝑲 (µmolL -1 ) Referência Tyr-CB-HNO3/H2SO4 1:1– DHP/GCE 82 Este trabalho * Tyr/nano–CaCO3 17 32 Graphite–Teflon–Tyr 16 39 Tyr–PPO–CaHPO4 7,2 40 *Determinação de NaBz. 4.7 Determinação amperométrica de NaBz baseada em inibição enzimática Uma vez encontradas as melhores condições experimentais e identificado o mecanismo de inibição, foi construída a curva analítica para a determinação de NaBz empregando-se amperometria. Na FIGURA 4.24 é apresentado o amperograma obtido para a determinação baseada na inibição enzimática. Observa-se a diminuição do sinal de corrente como consequência da adição do NaBz. 70 Resultados e Discussão 300 600 900 1200 1500 1800 -3 -2 -1 0 900 -2,7 -2,6 -2,5 -2,4 -2,3 -2,2 -2,1 t/ s I  A t/ s I  A FIGURA 4.24-Amperograma obtido para a adição de diferentes concentrações de NaBz (faixa de concentrações: 4,9 × 10 −7 ─ 9,2 × 10 −4 mol L −1 ). Concentração de catecol 5,0 × 10 −6 mol L −1 em solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5), potencial aplicado −0,2V e velocidade de agitação 450 rpm. Na FIGURA 4.25 apresenta-se o comportamento da porcentagem de inibição em função da concentração do NaBz, e o gráfico inserido corresponde à curva analítica. A equação que representa a curva analítica é: Inib(%) = 1,27 + 8,19 × 10 5 × [NaBz] (mol L −1 ). O limite de detecção (calculado como sendo três vezes o desvio padrão do intercepto da curva analítica dividido pela sensibilidade da curva) 1,17,90 foi calculado como 2,1 × 10 −7 mol L− 1 . 71 Resultados e Discussão FIGURA 4.25-Relação entre a porcentagem de inibição e a concentração de NaBz. Gráfico inserido: curva analítica. Na TABELA 4.8 é apresentada uma comparação entre os parâmetros analíticos obtidos para o biossensor de Tyr e CB funcionalizado e os encontrados na literatura para diversos biossensores de Tyr dedicados à determinação de ácido benzoico. Esta comparação é realizada levando em consideração que nas condições nas quais foram realizados estes trabalhos (pH entre 6,0 e 7,5) a espécie dominante em solução é o NaBz e não o ácido benzoico. Por exemplo, em solução com pH igual a 6,0; 98,6% das espécies se encontram na forma de NaBz considerando-se o 0 300 600 900 0 30 60 90 0 5 10 15 20 2 4 6 8 10 12 14 16 18 [NaBz]/1x10 -7 / mol L -1 I n ib / % [NaBz]/1x10 -7 / mol L -1 I n ib / % Inib(%) = 8,19 10 5 [NaBz] (molL -1 ) + 1,27 r= 0,991 72 Resultados e Discussão pKa do ácido benzoico igual a 4,20. Observa-se que o biossensor Tyr–CB– HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE apresentou um limite de detecção inferior ao obtido para o biossensor a base de Tyr imobilizada em uma matriz de grafite e Teflon 39 , e o limite de detecção foi maior em comparação com os outros biossensores. Pode-se atribuir isto à grande afinidade entre o substrato catecol e o biossensor de Tyr e CB funcionalizado, e este e outros parâmetros do método podem ser melhorados a partir da utilização de substratos que apresentem menor afinidade pelo dispositivo 32 . Ademais, o biossensor proposto tem vantagens em termos de custo e facilidade de preparação frente aos outros dispositivos encontrados na literatura. TABELA 4.8- Comparação dos parâmetros analíticos para diferentes biossensores de tirosinase na determinação de benzoato de sódio Biossensor Intervalo linear (µmol L −1 ) Limite de detecção (µmol L −1 ) Referência Graphite–Teflon– tyrosinase 1–40 0,90 39 Tyr–CB–HNO3/H2SO4 1:1–DHP/GCE 0,49–19 0,21 Este trabalho Tyr/nano–CaCO3 0,56–92 0,08 32 Tyr–PPO–CaHPO 4 0,030–3,0 0,03 40 Finalmente, a aplicabilidade do biossensor proposto na determinação de NaBz em amostras de cebolas em conserva foi avaliada a partir de estudos de adição e recuperação do analito. Para isto, uma alíquota de 950 µL de agua de conserva foi fortificada com NaBz e 100 µL foram adicionados na célula contendo 73 Resultados e Discussão 10 mL de solução de tampão fosfato 0,075 mol L −1 (pH 7,5) e uma concentração de catecol de 5,0 ×10 −6 mol L −1 para obter uma concentração de benzoato de sódio de 5,0 ×10 −6 mol L −1 . A concentração de NaBz foi determinada três vezes e a media e o desvio padrão foram calculados. Foi obtida uma porcentagen de recuperação de 91,2%, desta forma, mostrou-se que não houve interferência significativa da matriz da amostra sobre a determinação de NaBz utilizando o metodo proposto. 74 Conclusões 5 CONCLUSÕES Neste trabalho o CB Vulcan XC-72R foi funcionalizado mediante a aplicação de diferentes tratamentos de oxidação. Como consequência da funcionalização foram observadas mudanças nas propriedades físicas do material (como hidrofilicidade e grau de desordem) as quais tiveram uma influência significativa nas suas propriedades eletroquímicas. Os estudos mostraram uma vantagem do uso do CB funcionalizado com a mistura de ácido nítrico e sulfúrico 1:1 v/v para aplicações em eletroanálises, e esta vantagem vê-se refletida principalmente no incremento da sensibilidade. O melhor tratamento de funcionalização foi selecionado para a construção do biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE, e este foi aplicado na determinação de catecol utilizando-se amperometria. Foram obtidos melhores resultados (em termos de limite de detecção e sensibilidade) aos encontrados na literatura para outros biossensores de Tyr preparados utilizando materiais mais custosos. O biossensor foi aplicado na determinação de catecol em amostras de água obtendo-se bons resultados. Finalmente, foram realizados estudos do comportamento cinético do benzoato de sódio frente ao biossensor Tyr–CB–HNO3 /H2SO4 1:1–DHP/GCE, encontrando-se que a inibição segue o mecanismo reversível competitivo conforme ao encontrado na literatura para o ácido benzoico. O biossensor foi aplicado na determinação de benzoato de sódio e observaram-se respostas lineares na faixa de 4,90×10 −7 a 1,92×10 −5 mol L −1 e limite de detecção de 2,1 × 10 −7 mol L −1 . Estes resultados mostram a possibilidade de utilizar o CB funcionalizado na preparação de biossensores enzimáticos para a determinação tanto de substratos quanto de 75 Conclusões inibidores enzimáticos, com vantagens frente aos materiais geralmente utilizados em termos de custo e/ou simplicidade de preparação. 76 Referências Bibliográficas 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. OLIVEIRA, T. M. B. F.; FÁTIMA BARROSO, M.; MORAIS, S.; DE LIMA- NETO,P., CORREIA, A. N.; OLIVEIRA, M. B. P. & DELERUE-MATOS, C. “Biosensor based on multi-walled carbon nanotubes paste electrode modified with laccase for pirimicarb pesticide quantification”. Talanta, 106: 177-143, 2013. 2. TURNER, A. P. F. “Biosensors: sense and sensibility”. Chem. Soc. Rev., 42 (8): 3184-3196, 2013. 3. 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