dc.contributor.author | Alexandrino, André Vessoni | |
dc.date.accessioned | 2020-04-23T13:10:34Z | |
dc.date.available | 2020-04-23T13:10:34Z | |
dc.date.issued | 2020-02-20 | |
dc.identifier.citation | ALEXANDRINO, André Vessoni. Análise funcional dos genes xanB e xylA2 de Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico. 2020. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2020. Disponível em: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/12451. | * |
dc.identifier.uri | https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/12451 | |
dc.description.abstract | Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is the main bacterium that causes citrus canker, a disease that affects all citrus cultivars of commercial interest, causing damages to the citrus sector due to the decrease in fruit productivity and quality, and the lack of effective control and cure measures. In differential proteomic analysis previously conducted by our research group, phosphomannose isomerase (PMI) and xylose isomerase (XI) were proteins identified as potentially involved in the pathogenesis of citrus canker, the first being detected for the first time on the Xcc surface. Xcc PMI is predicted as a bifunctional enzyme with catalytic activity of interconverting D-mannose-6-phosphate into D-fructose-6-phosphate and D-mannose-1-phosphate to GDP-D-mannose. Xcc XI is also classified as a bifunctional enzyme that interconverts D-xylose into D-xylulose and D-glucose into D-fructose. The present work had as general objective the functional characterization of the coding genes of PMI and XI (xanB and xylA2, respectively), especially regarding the relationship with the Xcc pathogenicity, starting from strategies that involved the construction of IPTG-inducible heterologous expression systems in E. coli, which allowed the confirmation of the predicted biological activities of the target proteins. Homologous double recombination between the genomic DNA and the suicide vector pNPTS138 containing flanking regions of the target gene to be deleted was used to construct mutant strains deleted in the xanB and xylA2 genes (XccΔxanB and XccΔxylA2, respectively). A complementing strain for the first mutant (XccΔCxanB) was successfully obtained by reinserting the gene in the original locus using pNPTS138, an unprecedented methodology in Xcc. In vivo assays in Citrus aurantifolia were conducted using the Xcc, XccΔxanB, XccΔCxanB and XccΔxylA2 strains, which allowed the evaluation of the relationship of the target genes with the Xcc pathogenicity. Deletion of the xylA2 triggered an increase in Xcc virulence, which may be explained by the consequent accumulation of xylose and a possible increase in hrp gene expression. Deletion of the xanB resulted in loss of Xcc pathogenicity, with reduction of its properties related to the infectious process, such as motility, biofilm formation and resistance to ultraviolet radiation, with all these phenotypes being fully restored by gene complementation. Thus, the finding that the xanB is essential for the Xcc pathogenicity makes it a novel and promising target from a biotechnological point of view, providing the perspective of control and/or cure of citrus canker through the use of PMI inhibitors and also the development of citrus cultivars that neutralize the action of such protein during the infectious process. | eng |
dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | por |
dc.language.iso | por | por |
dc.publisher | Universidade Federal de São Carlos | por |
dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ | * |
dc.subject | Xanthomonas citri subsp. citri | por |
dc.subject | Fosfomanose Isomerase | por |
dc.subject | Xilose Isomerase | por |
dc.subject | Patogenicidade | por |
dc.subject | Virulência | por |
dc.subject | Phosphomannose isomerase | eng |
dc.subject | Xylose isomerase | eng |
dc.subject | Pathogenicity | eng |
dc.subject | Virulence | eng |
dc.title | Análise funcional dos genes xanB e xylA2 de Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico | por |
dc.title.alternative | Functional analysis of the xanB and xylA2 genes of Xanthomonas citri subsp. citri, causative agent of citrus canker | eng |
dc.type | Tese | por |
dc.contributor.advisor1 | Novo-Mansur, Maria Teresa Marques | |
dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/1198926223396748 | por |
dc.description.resumo | A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é a principal causadora do cancro cítrico, uma doença que acomete todas as cultivares cítricas de interesse comercial, ocasionando prejuízos ao setor citricultor devido à queda na produtividade e qualidade dos frutos, e à ausência de medidas eficazes de controle e cura. Em trabalhos de análise proteômica diferencial previamente conduzidos por nosso grupo de pesquisa, fosfomanose isomerase (PMI) e xilose isomerase (XI) foram proteínas identificadas como potencialmente envolvidas na patogênese do cancro cítrico, sendo a PMI detectada pela primeira vez na superfície de Xcc. A PMI de Xcc é predita como uma enzima bifuncional com atividades catalíticas de interconversão de D-manose-6-fosfato e D-frutose-6-fosfato, bem como de D-manose-1-fosfato em GDP-D-manose. A XI de Xcc também é classificada como uma enzima bifuncional que interconverte D-xilose em D-xilulose e D-glicose em D-frutose. O presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização funcional dos genes codificantes da PMI e da XI (xanB e xylA2, respectivamente), especialmente no tocante à relação com a patogenicidade de Xcc, partindo de estratégias que envolveram a construção de sistemas de expressão heteróloga induzíveis por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, os quais permitiram a confirmação das atividades biológicas preditas das proteínas-alvo. A dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico bacteriano e o vetor suicida pNPTS138 contendo regiões flanqueadoras do gene-alvo a ser deletado foi utilizada para a construção de linhagens mutantes deletadas nos genes xanB e xylA2 (XccΔxanB e XccΔxylA2, respectivamente). Uma linhagem complementante para o primeiro mutante (XccΔCxanB) foi obtida com sucesso pela reinserção do gene no lócus original utilizando o pNPTS138, uma metodologia inédita em Xcc. Ensaios in vivo em Citrus aurantifolia foram conduzidos utilizando as linhagens Xcc, XccΔxanB, XccΔCxanB e XccΔxylA2, os quais permitiram a avaliação da relação dos genes-alvo com a patogenicidade de Xcc. A deleção do gene xylA2 desencadeou um aumento na virulência de Xcc, o que pode ser explicado pelo consequente acúmulo de xilose e um possível aumento da expressão de genes hrp. A deleção do gene xanB, por sua vez, resultou na perda de patogenicidade de Xcc, com redução de suas propriedades relacionadas ao processo infeccioso, como motilidade, formação de biofilme e resistência à radiação ultravioleta, com todos esses fenótipos sendo integralmente restaurados pela complementação gênica. Sendo assim, a constatação de que o gene xanB é essencial para a patogenicidade de Xcc o torna um alvo inédito e bastante promissor do ponto de vista biotecnológico, propiciando uma perspectiva de controle e/ou cura do cancro cítrico por meio da utilização de inibidores da PMI e, também, do desenvolvimento de cultivares cítricas que neutralizem a ação de tal enzima durante o processo infeccioso. | por |
dc.publisher.initials | UFSCar | por |
dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - PPGBiotec | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOFISICA::BIOFISICA MOLECULAR | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS::BACTEROLOGIA | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOQUIMICA DOS MICROORGANISMOS | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS | por |
dc.description.sponsorshipId | CAPES: 88882.426495/2019 - 001 | por |
dc.publisher.address | Câmpus São Carlos | por |
dc.contributor.authorlattes | http://lattes.cnpq.br/2594277065273566 | por |