dc.contributor.author | Neves, José Davi dos Santos | |
dc.date.accessioned | 2024-07-23T19:27:36Z | |
dc.date.available | 2024-07-23T19:27:36Z | |
dc.date.issued | 2023-02-27 | |
dc.identifier.citation | NEVES, José Davi dos Santos. Construção de linhagens de Escherichia coli para produção heteróloga de fenazinas. 2023. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2023. Disponível em: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/20221. | * |
dc.identifier.uri | https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/20221 | |
dc.description.abstract | Phenazines are a class of secondary metabolites produced by some species of microorganisms,
with great potential for biotechnological application. However, the production of these
compounds has been performed only in naturally producing microorganisms, restricting the
viability of its application, since some of these organisms are pathogenic and others present very
limited production. Thus, the objective of this work is to produce these molecules in Escherichia
coli cells, heterologously. To this end, genes involved in the biosynthesis of the selected
phenazines were cloned and expressed using BioBricks-based vectors. Starting from the
phzABCDEFG gene cluster from Pseudomonas aeruginosa, responsible for the production of
phenazine-1-carboxylic acid (PCA), strategies were adopted for production of derived
phenazines. For production of phenazine-1,6-dicarboxylic acid (PDC), it was necessary to
remove the phzA gene from the mentioned cluster. However, when culture and subsequent mass
spectrometry analysis were performed, it was not possible to identify the target molecule. Still
on the PDC production, the homologous recombination technique was employed in order to
replace the phzABG genes by the esmA1 and esmA2 genes from Streptomyces antibioticus Tü
2706, but no positive colonies were generated. For the production of 1-methoxyphenazine
(PMO), the LaphzM gene from Lysobacter antibioticus was used, which, together with the phzS
gene from P. aeruginosa, enabled the conversion of PCA into PMO. In this case, after culturing
the recombinant strain, it was possible to identify the mass of the target molecule of interest,
produced for the first time in a heterologous manner, to the best of our knowledge. In the
production of PMO, different E. coli strains, concentrations of the inducer IPTG, and different
carbon sources were evaluated, reaching a production of 421mg/L. It was also possible to
successfully produce endofenazine A, using the ppzP gene from Streptomyces anulatus, which
encodes a prenyltransferase, together with plasmids for the expression of genes from the S.
cerevisiae mevalonate pathway, and the cluster for PCA production. The confirmation of the
production of these molecules was performed by mass spectrometry and liquid chromatography,
and in initial experiments it was possible to reach final concentrations around 200 mg/L of the
product of interest. | eng |
dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | por |
dc.language.iso | por | por |
dc.publisher | Universidade Federal de São Carlos | por |
dc.rights | Attribution-NoDerivs 3.0 Brazil | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/br/ | * |
dc.subject | Fenazinas | por |
dc.subject | Biotecnologia | por |
dc.subject | Engenharia metabólica | por |
dc.subject | Metabólitos secundários | por |
dc.subject | Phenazines | eng |
dc.subject | Biotechnology | eng |
dc.subject | Metabolic engineering | eng |
dc.subject | Secondary metabolites | eng |
dc.title | Construção de linhagens de Escherichia coli para produção heteróloga de fenazinas | por |
dc.title.alternative | Construction of Escherichia coli strains for heterologous production of phenazines | eng |
dc.type | Dissertação | por |
dc.contributor.advisor1 | Silva, Adilson José da | |
dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/3447469350644179 | por |
dc.description.resumo | As fenazinas compõem uma classe de metabólitos secundários produzidos por algumas espécies
de microrganismos, com grande potencial de aplicação biotecnológica. Porém, a produção desses
compostos tem sido realizada apenas nos microrganismos naturalmente produtores, restringindo
a viabilidade de sua aplicação, já que alguns destes organismos são patogênicos e outros
apresentam produção bastante limitada. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é produzir essas
moléculas em células de Escherichia coli, de forma heteróloga. Para isso, os genes envolvidos
na biossíntese das fenazinas selecionadas foram clonados e expressos utilizando vetores
baseados em BioBricks. Partindo do cluster de genes phzABCDEFG de Pseudomonas
aeruginosa, responsável pela produção da fenazina-1-ácido carboxílico (PCA), foram adotadas
estratégias para produção de fenazinas derivadas. Para produção da fenazina-1,6-ácido
dicarboxílico (PDC), se fazia necessária a remoção do gene phzA do cluster mencionado.
Entretanto, quando realizado cultivo e posterior análise de espectrometria de massa, não foi
possível identificar a molécula alvo. Ainda sobre a produção da PDC, foi empregada a técnica de
recombinação homóloga, afim de substituir os genes phzABG pelos genes esmA1 e esmA2 de
Streptomyces antibioticus Tü 2706, porém não foram geradas colônias positivas. Já para a
produção da 1-metoxifenazina (PMO) foi utilizado o gene LaphzM de Lysobacter antibioticus,
que em conjunto com o gene phzS de P. aeruginosa, possibilitou a conversão da PCA em PMO.
Neste caso, após a realização do cultivo da linhagem recombinante, foi possível identificar a
massa da molécula alvo de interesse, produzida pela primeira vez de forma heteróloga, até onde
sabemos. Na produção da PMO foram avaliadas diferentes linhagens de E. coli, concentrações
do indutor IPTG, além de diferentes fontes de carbono, atingindo-se uma produção de 421mg/L.
Também foi possível produzir com sucesso a endofenazina A, com a utilização do gene ppzP de
Streptomyces anulatus, que codifica uma preniltransferase, em conjunto com plasmídeos para
expressão de genes da via do mevalonato de S. cerevisiae, além do cluster para produção da PCA.
A confirmação da produção dessas moléculas foi realizada por espectrometria de massas e em
cromatografia líquida, e em experimentos iniciais foi possível atingir concentrações finais em
torno de 200 mg/L do produto de interesse. | por |
dc.publisher.initials | UFSCar | por |
dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQ | por |
dc.subject.cnpq | ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA::PROCESSOS INDUSTRIAIS DE ENGENHARIA QUIMICA | por |
dc.description.sponsorshipId | 88887.605416/2021-00 | por |
dc.publisher.address | Câmpus São Carlos | por |
dc.contributor.authorlattes | http://lattes.cnpq.br/4355710461402200 | por |
dc.contributor.authororcid | https://orcid.org/0000-0001-6768-6850 | por |
dc.contributor.advisor1orcid | https://orcid.org/0000-0002-3362-6208 | por |