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Expressão, purificação e caracterização das luciferases de Cratomorphus distinctus (Lampyridae) e Euryopa clarindae (Phengodidae) e sondagem de suas aplicabilidades
dc.contributor.author | Benites, Gabrielle Rodrigues | |
dc.date.accessioned | 2024-09-03T17:38:46Z | |
dc.date.available | 2024-09-03T17:38:46Z | |
dc.date.issued | 2024-08-02 | |
dc.identifier.citation | BENITES, Gabrielle Rodrigues. Expressão, purificação e caracterização das luciferases de Cratomorphus distinctus (Lampyridae) e Euryopa clarindae (Phengodidae) e sondagem de suas aplicabilidades. 2024. Dissertação (Mestrado em Genética Evolutiva e Biologia Molecular) – Universidade Federal de São Carlos, Sorocaba, 2024. Disponível em: https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/20462. | * |
dc.identifier.uri | https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/20462 | |
dc.description.abstract | Luciferases are the enzymes that catalyze the bioluminescence reaction in organisms such as beetles. Bioluminescence has been used for bioanalytical purposes for decades, including ATP detection assays, enzymatic assays, microbiological contamination of products in the food industry, as a reporter gene for pollutant biosensors, intracellular pH and heavy metal indicators, and bioimaging. Our research group has cloned the largest number and variety of beetle luciferases in the world, some already having bioanalytical applications, however there are still several luciferases and mutant forms with interesting properties that we have produced, but which have not yet been well characterized and applied. With the aim of expanding the range of applications, especially in biosensors for pH and potentially toxic metals, we carried out the characterization of the pH-sensitive luciferases from the lampyrid C. distinctus and the orange light-emitting luciferase from the phengodid E. clarindae. To achieve this, we subcloned the luciferase cDNA from C. distinctus and E. clarindae into a pCold vector, transformed E. coli BL21DE3 bacteria and expressed and purified the two luciferases by affinity chromatography on nickel-agarose resin. The tests showed that the C. distinctus luciferase has a high catalytic efficiency for ATP and lower for LH2, when compared to other lampyrid luciferases, in addition to having excellent sensitivity to pH and metals, especially mercury. The E. clarindae luciferase showed a high KM for LH2 and low for ATP, when compared to luciferases from other phengodids. Thus, C. distinctus luciferase has potential applicability as a mercury and pH sensor protein; while the insensitive luciferase from E. clarindae has potential as a reporter gene. Furthermore, the orange light-emitting luciferase from E. clarindae constitutes another important model to understand the structure x bioluminescence spectra relationship in coleopteran luciferases and the origin of the different bioluminescence colors. | por |
dc.description.sponsorship | Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) | por |
dc.description.sponsorship | Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) | por |
dc.language.iso | por | por |
dc.publisher | Universidade Federal de São Carlos | por |
dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ | * |
dc.subject | Luciferases | por |
dc.subject | Biossensor | por |
dc.subject | Biosensor | eng |
dc.subject | C. distinctus | por |
dc.subject | E. clarindae | por |
dc.title | Expressão, purificação e caracterização das luciferases de Cratomorphus distinctus (Lampyridae) e Euryopa clarindae (Phengodidae) e sondagem de suas aplicabilidades | por |
dc.title.alternative | Expression, purification and characterization of luciferases from Cratomorphus distinctus (Lampyridae) and Euryopa clarindae (Phengodidae) and investigation of their applicability | eng |
dc.type | Dissertação | por |
dc.contributor.advisor1 | Viviani, Vadim Ravara | |
dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/3942043373510668 | por |
dc.description.resumo | Luciferases são as enzimas que catalisam a reação de bioluminescência em organismos como besouros. A bioluminescência tem sido utilizada com propósitos bioanalíticos há décadas, incluindo ensaios de detecção de ATP, ensaios enzimáticos, contaminação microbiológica de produtos na indústria alimentícia, como gene repórter para biossensores de poluentes, indicadores de pH intracelular e metais pesados, e bioimagem. Nosso grupo de pesquisa clonou o maior número e variedade de luciferases de besouros no mundo, algumas já tendo aplicações bioanalíticas, entretanto ainda existem várias luciferases e formas mutantes com propriedades interessantes que produzimos, mas que ainda não foram bem caracterizadas e aplicadas. Com o objetivo de ampliar a gama de aplicações, especialmente em biossensores de pH e metais potencialmente tóxicos, realizamos a caracterização das luciferases pH-sensitiva do lampirídeo C. distinctus e da emissora de luz laranja do fengodídeo E. clarindae. Para isso, fizemos a subclonagem do cDNA da luciferase de C. distinctus e E. clarindae em vetor pCold, transformamos bactérias E. coli BL21DE3 e expressamos e purificamos as duas luciferases por cromatografia de afinidade em resina de níquel-agarose. Os ensaios mostraram que a luciferase de C. distinctus possui uma eficiência catatílica alta para ATP e menor para LH2, quando comparada a outras luciferases de lampirídeos, além de ter uma excelente sensibilidade a pH e a metais, principalmente a mercúrio. A luciferase de E. clarindae apresentou KM alto para LH2 e baixo para ATP, quando comparada às luciferases de outros fengodídeos. Dessa forma, a luciferase de C. distinctus apresenta potencial aplicabilidade como proteína sensora de mercúrio e pH; enquanto que a luciferase insensitiva de E. clarindae tem potencial como gene repórter. Além disto, a luciferase emissora de luz laranja de E. clarindae constitui mais um modelo importante para compreender a relação estrutura x espectros de bioluminescência em luciferases de coleópteros e a origem das diferentes cores de bioluminescência. | por |
dc.publisher.initials | UFSCar | por |
dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular - PPGGEv | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA | por |
dc.subject.cnpq | CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA | por |
dc.description.sponsorshipId | Processo n° 130866/2022-9 e 405060/2021-1, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) | por |
dc.description.sponsorshipId | Processo n° 2022/04800-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) | por |
dc.publisher.address | Câmpus Sorocaba | por |
dc.contributor.authorlattes | http://lattes.cnpq.br/8331548591902783 | por |
dc.contributor.authororcid | https://orcid.org/0009-0003-0675-4225 | por |
dc.contributor.advisor1orcid | https://orcid.org/0000-0001-5558-9199 | por |