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dc.creatorOguri, Renata Tieko
dc.date.accessioned2016-06-02T19:56:30Z
dc.date.available2007-11-14
dc.date.available2016-06-02T19:56:30Z
dc.date.issued2006-12-20
dc.identifier.citationOGURI, Renata Tieko. Estudo de condições operacionais na produção de penicilina G acilase por diferentes microrganismos.. 2006. 137 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Exatas e da Terra) - Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2006.por
dc.identifier.urihttps://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/3989
dc.description.abstractPenicillin G acylase (PGA) is an enzyme of major impact in human health for catalyzing the deacilation of the penicillin G, to yield 6-aminopenicillanic acid (6- APA), key intermediate in the semi-synthetic antibiotics production. Several microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is capable of secreting it to the medium. PGA from B. megaterium has been studied in DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris presents in your DNA the genetic sequence that codify acylase penicillin and tests with a strain of this microorganism from Departamento de Genética e Evolução da UFSCar showed PGA extracellular production. Studies in PGA production were initiated with the microorganism stored in DEQ-UFSCar. At the same time, strains of X. campestris from Coleção de Culturas Tropical (CCT) and Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) were tested. However, assays with these strains showed little cellular growth and no enzymatic activity. The microorganism reactivated was send to Fundação André Toselo for identification. The result showed that the microorganism was Bacillus megaterium. Therefore, at the same time that realized adaptations tries with the new strain of X. campestris, studies of production operational conditions of PGA were performed with strain of Bacillus megaterium, in shaking flasks and bioreactor, as well the enzyme characterization Germination/ propagation of B. megaterium experiments, at 30°C, carried out in shaking flasks showed that the growth time of microorganism in the inoculum step was 24 hours and maximum specific growth rate was µmáx = 0.33h-1. Assays in shaking flasks were carried out in shaker at 30ºC and 300 rpm intend to determine the most adequate pH for the enzyme production in both, microorganism propagation phase and enzyme production phase The results showed that the best pHs among the tested ones were pH 8.0 and 7.0, for the propagation and production phases, respectively, with 355 IU/L. The culture medium with preferentially consumed amino acids 20,0 g/L, potassium phenylacetate 3,5 g/L, solution with differents salts 0,22 g/L and cheese whey 20,0 g/L was the more efficient in PGA production, carried out maximum cellular growth and enzymatic activity, 4,59 g/L and 592UI/L, respectively, in 36 hours. Assays in a 2-L bioreactor, with production medium in the presence of amino acids preferably consumed 10.0 g/L, cheese whey 20.0 g/L, solution of salts 0.22 g/L and inducer potassium phenylacetate 3.5 g/L, indicated that the addition of nutrients during the fermentation is a efficient strategy, providing enzyme production increase. In the study of the influence of oxygen dissolved, carried out in bioreactor too, maximum enzymatic activity was 451 IU/L with 10% of saturation. Moreover, the maximum enzyme production was observed in the bioreactor and not in shaking flasks, like in all experiments until this. In the stage of characterization of the penicillin G acylase from Bacillus megaterium, optimum values of temperature and pH were, 47°C and 8.0, respectively. The Michaelis Menten model fitted resulting in estimated Km and Vmáx parameters values of 1.51 mM and 1.1*10-3 mmol/min*IU, respectively. The activation energy estimated was 27.12 KJ/mol.The results showed that PGA from Bacillus megaterium deactivate completely after 45 minutes of incubation at 60°C and 90 minutes in pH 11.0.eng
dc.description.sponsorshipUniversidade Federal de Sao Carlos
dc.formatapplication/pdfpor
dc.languageporpor
dc.publisherUniversidade Federal de São Carlospor
dc.rightsAcesso Abertopor
dc.subjectEngenharia bioquímicapor
dc.subjectPenicilina G acilase - produçãopor
dc.subjectXanthomonaspor
dc.subjectBacillus megateriumpor
dc.titleEstudo de condições operacionais na produção de penicilina G acilase por diferentes microrganismospor
dc.typeDissertaçãopor
dc.contributor.advisor1Giordano, Raquel de Lima Camargo
dc.contributor.advisor1Latteshttp://genos.cnpq.br:12010/dwlattes/owa/prc_imp_cv_int?f_cod=K4780181P0por
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/9847634405993955por
dc.description.resumoPenicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana, pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para a obtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção de antibióticos β-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre os quais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGA por esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e teste preliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento de Genética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado, por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-se cultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foram obtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção de Culturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivos dessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, sem produção de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que se vinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. O microrganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. O laudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado era Bacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado, pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumas diferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismo produtor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas de adaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foram investigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com o microrganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa shaker como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida. Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizados em shaker , mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, com velocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde se obtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH 7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é a temperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção da enzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmente pelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentes sais 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção da PGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592 UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento e produção iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C. Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição de nutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveis de produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção de PGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz à máxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima para oxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator e não no ensaio em shaker , sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores já obtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram 47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo de Michaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisada por PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida da enzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos de exposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGA após 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.por
dc.publisher.countryBRpor
dc.publisher.initialsUFSCarpor
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQpor
dc.subject.cnpqENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICApor


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