Caracterização bioquímica e funcional de F-box like proteins em Leishmania infantum

Abstract

A proteólise intracelular em eucariotos é mediada principalmente pelo Sistema Ubiquitina–Proteassoma (SUP), que envolve as enzimas E1, E2 e E3, sendo estas últimas responsáveis pelo reconhecimento dos substratos. Em protozoários parasitos, como Leishmania infantum, o SUP é essencial para adaptação ao ciclo de vida e sucesso do parasitismo, embora ainda seja pouco explorado, especialmente as E3 ubiquitina-ligases. Este estudo teve como objetivo caracterizar bioquimicamente e funcionalmente as proteínas F-box-like LinfFlp2 (LINF_240015400) e LinfFlp3 (LINF_150014400), adaptadores da E3 ubiquitina ligase LinfCRL1 de L. infantum. Parasitos expressando LinfFLP2-HA e LinfFLP3-HA foram submetidos à imunoprecipitação seguida de espectrometria de massas para identificação de proteínas associadas. Os interactomas revelaram 44 proteínas exclusivas para LinfFlp2, 125 para LinfFlp3 e 106 proteínas compartilhadas nos interactomas de LinfFlp2 e LinfFlp3, sugerindo redundância funcional. Para validação das interações em células HEK293T, os genes Replication protein A subunit (LINF_280024500), RNA-binding protein 29 – putative (LINF_180007200), Leucine-rich repeat protein – putative (LINF_340011100) e Putative mitochondrial carrier protein (LINF_020012000) foram clonados em vetores para expressão em células de mamíferos em fusão com myc no N-terminal. Ensaios de co-imunoprecipitação demonstraram que a proteína LRR é um potencial ligante de LinfFlp3. Em L. infantum, demonstramos através de CRISPR-Cas9 que as linhagens nocaute de LinfFLP2 não resultou em impacto no crescimento promastigota, enquanto não foi possível obter o nocaute completo de LinfFLP3, sugerindo caráter essencial. A inserção de uma cópia de LinfFLP3-HA no locus 18S ribossomal do parasito e posterior nocaute das duas cópias genômicas resultou em linhagem viável (DKO-LinfFLP3-HA), reforçando a essencialidade deste gene para L. infantum. O nocaute de uma das cópias do gene SKO LinfFLP3, DKO-LinfFLP3-HA e LinfFLP2-HA não apresentou alteração significativa de crescimento e não observamos alteração nas fases do ciclo celular das linhagens SKO-LinfFLP3 ou DKO-LinfFLP3-HA. Finalmente, análises de microscopia confocal demonstraram que LinfFlp2 e LinfFlp3 apresentam distribuição predominantemente citoplasmática granular e perinuclear com sutil localização nuclear. Em conjunto, os dados sugerem redundância funcional entre LinfFlp2 e LinfFlp3, ampliando a compreensão das LinfFlps na biologia de L. infantum.